綿羊布魯氏菌侵染小鼠巨噬細胞過程的熒光表征與分析.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建穩(wěn)定表達GFP的整合型重組布魯氏菌16M和M5(以下簡稱GFP-布魯氏菌16M和M5);比較GFP-布魯氏菌16M和M5與正常布魯氏菌16M和M5在巨噬細胞中的存活能力,證明GFP基因的轉(zhuǎn)入不會影響后續(xù)實驗的進行。分析GFP-布魯氏菌16M和M5進入細胞后與宿主細胞中的溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體結(jié)合產(chǎn)生的熒光強度;分析GFP-布魯氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬細胞的數(shù)量;對侵染初期與胞內(nèi)溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體結(jié)合的時

2、間測定,為布魯氏菌在細胞內(nèi)的生存繁殖及其分子機制研究提供理論參考。
　　方法:
　　將pMC-221-GFP載體電轉(zhuǎn)化進入布魯氏菌16M和M5感受態(tài)細胞,穩(wěn)定傳代后獲得GFP-布魯氏菌16M和M5。將GFP-布魯氏菌16M和M5與正常布魯氏菌16M和M5培養(yǎng)至對數(shù)期收集菌體,用麥氏比濁法至所需濃度,按照細菌和細胞比例為100:1進行侵染,利用平板計數(shù)法檢測其在胞內(nèi)的存活能力;激光共聚焦顯微鏡觀察胞內(nèi)GFP-布魯氏菌與溶酶體,

3、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的結(jié)合,并檢測出GFP-布魯氏菌16M和M5與溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體結(jié)合后產(chǎn)生的熒光強度;用流式細胞儀測定侵染初期GFP-布魯氏菌進入細胞及與胞內(nèi)溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體初次結(jié)合的時間。
　　結(jié)果:
　　(1)成功獲得整合重組型GFP-布魯氏菌16M和M5。
　　(2)GFP-布魯氏菌16M和M5與正常布魯氏菌16M和M5比較發(fā)現(xiàn)在小鼠巨噬細胞中的存活能力并無差別。
　　(3)GFP-布魯氏

4、菌16M與溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體結(jié)合初期產(chǎn)生的熒光強度與布魯氏菌M5相比較并無明顯差異。
　　(4)GFP-布魯氏菌16M和M5侵染初期小鼠巨噬細胞產(chǎn)生的GFP+巨噬細胞沒有明顯區(qū)別,但是后期差距逐漸明顯。
　　(5)GFP-布魯氏菌16M和M5侵染初期10min進入巨噬細胞,1.5 h布魯氏菌到達溶酶體,2 h布魯氏菌同時到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體。
　　結(jié)論:
　　(1)GFP基因的整合重組并不會

5、影響布魯氏菌16M和M5的生物特性。
　　(2)GFP-布魯氏菌16M和M5在侵染初期結(jié)合宿主細胞及胞內(nèi)溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的時間相同,這可能與二者同屬布魯氏菌Ⅰ型標準菌株有關(guān)。
　　(3)GFP-布魯氏菌到達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的時間相同,這可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的膜轉(zhuǎn)移蛋白有關(guān)。
　　(4)雖然布魯氏菌16M和M5在侵染初期熒光強度和GFP+巨噬細胞數(shù)量上沒有顯著差別,但是胞內(nèi)存活實驗結(jié)果卻恰恰相反。由此認為布