實時示蹤研究艾滋病毒侵染巨噬細胞的行為與機制.pdf

1、巨噬細胞是人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的重要宿主細胞，但目前對于HIV侵染人原代巨噬細胞的機制尚不十分清楚。近年來，熒光納米標記和單病毒示蹤技術(shù)為實時動態(tài)研究病毒侵染細胞關(guān)鍵分子事件提供了有效方法。本研究構(gòu)建了一種量子點特異性標記HIV-1核心內(nèi)部蛋白Vpr的方法，獲得了量子點熒光標記病毒HIV-1-QD，并成功地應用單顆粒示蹤技術(shù)研究了HIV-1病毒侵染人原代巨噬細胞的行為模式，

2、具體研究結(jié)果如下：
　　第一，量子點標記病毒HIV-1-QD的制備及表征。把含有HIV-1前病毒全基因組質(zhì)粒pAD8、表達Vpr-AP融合蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Vpr-AP和表達生物素連接酶BirA的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-BirA共轉(zhuǎn)染入293T細胞，并在細胞中導入生物素以及鏈霉親和素修飾的量子點，使得量子點在病毒組裝過程中包裝入子代病毒粒子，純化獲得HIV-1-QD病毒顆粒。對HIV-1-QD病毒進行免疫熒光、

3、透射電鏡等表征，證實量子點成功包裝至HIV-1病毒核心內(nèi)部。病毒滴度測定結(jié)果表明標記方法未對病毒的侵染能力產(chǎn)生顯著性影響。
　　第二，發(fā)現(xiàn)HIV-1-QD通過內(nèi)吞的方式侵染人原代巨噬細胞。利用構(gòu)建的HIV-1-QD病毒，結(jié)合病毒脂質(zhì)囊膜的親脂性染料DiO染色，獲得了雙標記HIV-1-QD-DiO病毒顆粒，并將其用于病毒侵染巨噬細胞的動態(tài)行為研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV-1-QD-DiO病毒粒子以主動運輸?shù)姆绞竭M入巨噬細胞。HIV-1-Q

4、D-DiO病毒粒子的包膜熒光信號DiO和核心QD熒光信號共定位進入到巨噬細胞內(nèi)。進一步實時動態(tài)研究HIV-1-QD病毒粒子與巨噬細胞網(wǎng)格蛋白和早期內(nèi)體標志物Rab5A的相互作用，表明HIV-1通過網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞進入巨噬細胞，繼而轉(zhuǎn)運到早期內(nèi)體，并可從早期內(nèi)體中逃逸出來。抑制劑干擾實驗結(jié)果同樣顯示，干擾巨噬細胞的內(nèi)吞作用，將對HIV-1進入巨噬細胞產(chǎn)生顯著的影響。上述結(jié)果表明，HIV-1-QD病毒顆粒通過內(nèi)吞方式進入到巨噬細胞中。

5、r>　　第三，實時示蹤病毒囊膜與細胞內(nèi)體發(fā)生膜融合，釋放病毒核心完成有效進入重要事件。對雙標記病毒HIV-1-QD-DiO侵染巨噬細胞的早期行為進行實時動態(tài)示蹤研究，發(fā)現(xiàn)病毒經(jīng)內(nèi)吞進入巨噬細胞后可釋放病毒核心至細胞胞漿，完成病毒的有效進入。結(jié)合對細胞內(nèi)體等組分的熒光標記，證實HIV-1病毒粒子通過其囊膜與巨噬細胞早期內(nèi)體發(fā)生膜融合而釋放病毒核心至細胞質(zhì)中，實現(xiàn)病毒侵染的有效進入過程。藥物抑制實驗也證實了HIV-1病毒粒子囊膜與內(nèi)體發(fā)生膜

6、融合這一事件在HIV-1感染巨噬細胞過程中具有重要作用。
　　第四，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞肌動蛋白對HIV-1侵染巨噬細胞具有重要作用。通過對HIV-1-QD侵染的巨噬細胞肌動蛋白進行鬼筆環(huán)肽熒光染色，以及實時動態(tài)研究肌動蛋白在侵染過程中與HIV-1-QD的相互作用，發(fā)現(xiàn)細胞肌動蛋白的動態(tài)聚合解聚對HIV-1進入巨噬細胞、在細胞中的轉(zhuǎn)運等都具有重要作用。肌動蛋白相關(guān)抑制劑可顯著抑制病毒的有效感染。
　　綜上所述，本研究構(gòu)建了病毒衣殼內(nèi)