通心絡(luò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞增殖與遷移.pdf

1、目的:腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα，TNF-α)是一種具備多種生物學(xué)功能的強(qiáng)效細(xì)胞因子，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生。作為免疫和炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，TNF-α可以誘生其它細(xì)胞因子，誘導(dǎo)細(xì)胞的抗病毒活性，刺激血管形成以及成纖維細(xì)胞有絲分裂等。在生理狀態(tài)下，它具有抗腫瘤、抗感染和促進(jìn)組織修復(fù)等重要作用，對(duì)機(jī)體有利;一旦持續(xù)釋放，則會(huì)引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，造成機(jī)體發(fā)熱、休克、

2、惡病質(zhì)和組織損傷。因此，抑制TNF-α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，是治療多種疾病的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。
　　通心絡(luò)(TXL)含有水蛭、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、土鱉蟲等蟲類藥物和人參、赤芍等植物藥物成分。研究證明，通心絡(luò)具有改善血管內(nèi)皮功能、舒張血管、溶栓、抗凝、調(diào)節(jié)血脂、穩(wěn)定斑塊、抗炎、抗氧化等功能。臨床研究表明，通心絡(luò)可以降低心絞痛患者體內(nèi)C反應(yīng)蛋白水平，同時(shí)能夠抑制炎性因子產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)能夠抑制IL-1β介導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈血管壁的炎性反應(yīng)，緩解內(nèi)

3、膜增生及減輕血管狹窄，其作用可能是通過下調(diào)炎性因子及黏附因子表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。巨噬細(xì)胞增殖及向血管壁遷移在血管炎性反應(yīng)和內(nèi)膜增生中發(fā)揮重要作用，然而，目前對(duì)TXL是否影響巨噬細(xì)胞的增殖和遷移尚不十分清楚，本研究探討TNF-α對(duì)巨噬細(xì)胞增殖和遷移的影響，觀察TXL是否可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。
　　方法:Real-time PCR和Western blot分析檢測(cè)TNF-α對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 cycli

4、n D1、cyclin E1和mmp-2等基因表達(dá)的影響;傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞遷移能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照和給藥組，兩組動(dòng)物分別用水和TXL灌胃7天后，尾靜脈注射TNF-α誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，取血檢測(cè)血常規(guī)和C反應(yīng)蛋白;取小鼠骨髓巨噬細(xì)胞檢測(cè)cyclinD1、cyclin E1和mmp-2基因表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.TNF-α誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞cyclin D1和cyclin E1表達(dá)Wester

5、n blot分析結(jié)果顯示，分別用0、1、10、100 ng/ml TNF-α刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，cyclin D1和cyclin E1蛋白表達(dá)明顯升高。
　　用10 ng/ml TNF-α分別刺激RAW264.7細(xì)胞0、6、12、24 h后，cyclinD1和cyclin E1蛋白表達(dá)隨刺激時(shí)間延長而逐漸上調(diào)。以上結(jié)果表明，TNF-α可劑量和時(shí)間依賴性的誘導(dǎo)增殖相關(guān)基因表達(dá)。
　　Real-ti

6、me PCR結(jié)果也顯示，與對(duì)照組相比，TNF-α刺激使cyclin D1和cyclin E1 mRNA水平呈時(shí)間和劑量依賴性增加。這些結(jié)果表明，TNF-α通過誘導(dǎo)cyclin D1和cyclin E1表達(dá)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖。
　　2.通心絡(luò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞增殖用通心絡(luò)(TXL)預(yù)孵育RAW264.7細(xì)胞24 h后，再給予TNF-α刺激24 h，檢測(cè)cyclin D1和cyclin E1蛋白水平。W

7、estern blot結(jié)果顯示，TXL預(yù)處理組較單純TNF-α刺激組，cyclin D1和cyclin E1蛋白表達(dá)下調(diào)。Real-time PCR分析結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，TXL抑制TNF-α誘導(dǎo)的cyclin D1和cyclin E1表達(dá)。
　　3.TNF-α誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞mmp-2表達(dá)用不同濃度的TNF-α（0、1、10、100 ng/ml）分別刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，進(jìn)

8、行Western blot分析。結(jié)果顯示，隨著TNF-α濃度增加，遷移相關(guān)基因mmp-2的表達(dá)水平呈劑量依賴性升高。用10 ng/ml TNF-α刺激RAW264.7細(xì)胞0、6、12、24 h后，隨刺激時(shí)間延長，mmp-2表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加。Real-time PCR分析結(jié)果與Western blot分析結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，TNF-α通過誘導(dǎo)mmp-2表達(dá)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞遷移。
　　4.通心絡(luò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的RA

9、W264.7細(xì)胞遷移用TXL預(yù)孵育RAW264.7細(xì)胞24 h后，再給予TNF-α刺激24 h，觀察mmp-2表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示，TXL預(yù)處理組較單純TNF-α刺激組，mmp-2表達(dá)水平下調(diào)。Real-time PCR分析結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。
　　傷口愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用TXL預(yù)孵育RAW264.7細(xì)胞24 h后，再用10 ng/ml TNF-α刺激24 h，檢查細(xì)胞遷移情況。HE染色結(jié)

10、果顯示，TXL可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞遷移。
　　上述結(jié)果顯示，TXL通過抑制mmp-2表達(dá)而抑制TNF-α誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞遷移。
　　5通心絡(luò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)小鼠分為對(duì)照和給藥兩組，分別用水和TXL灌胃7天后，尾靜脈注射TNF-α0.1 mg/kg。檢查結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠體溫、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平均明顯升高。與對(duì)照組相比，給藥組小鼠體溫、C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞、中性粒細(xì)

11、胞均顯著下降，骨髓巨噬細(xì)胞中cyclin D1、cyclin E1和mmp-2 mRNA水平降低。以上結(jié)果表明，TXL通過抑制cyclinD1、cyclin E1和mmp-2表達(dá)，抑制TNF-α誘導(dǎo)的小鼠機(jī)體內(nèi)炎性反應(yīng)。
　　結(jié)論:
　　1..TNF-α促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖相關(guān)基因cyclin D1和cyclin E1表達(dá)。
　　2.通心絡(luò)通過下調(diào)cyclin D1和cyclin E1表達(dá)，抑制TNF-α誘導(dǎo)的