嗜吞噬細(xì)胞無形體四型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白系統(tǒng)性鑒定及其抗原性研究.pdf

1、目的：
　　四型分泌系統(tǒng)（type IV secretion system，T4SS）在病原菌致病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其通過向宿主細(xì)胞內(nèi)分泌多種效應(yīng)分子，使宿主細(xì)胞生理功能失調(diào)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。為闡明人粒細(xì)胞無形體病（human granulocytic anaplasmosis，HGA）的發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用生物信息學(xué)分析，尋找嗜吞噬細(xì)胞無形體（Anaplasma phagocytophilum，AP）T4SS潛在效應(yīng)分子，研究

2、其生物學(xué)功能，同時鑒定HGA新型診斷抗原，為HGA的診斷、治療和預(yù)防提供重要的新依據(jù)。
　　方法：
　　一．嗜吞噬細(xì)胞無形體T4SS潛在效應(yīng)分子的篩選、原核表達(dá)及抗體制備
　　1.篩選AP T4SS潛在效應(yīng)分子。以AP基因組編碼的610個未知功能蛋白為目標(biāo)，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)，根據(jù)T4SS效應(yīng)分子共同特點(diǎn)，篩選潛在的效應(yīng)分子。
　　2．重組蛋白表達(dá)。將篩選獲得的APH0177、APH0248、APH0261、AP

3、H0615、APH0653、APH0812、APH1127及已鑒定的T4SS效應(yīng)分子Ats-1為實(shí)驗(yàn)對象，按各自基因特征設(shè)計(jì)引物，以AP基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆入原核表達(dá)載體 pET28a(+)，進(jìn)行表達(dá)和純化。同時，另一個篩選獲得的效應(yīng)分子APH0215，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將aph0215(90-144)和aph0215(77-144)克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，并引入6×His標(biāo)簽，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL2

4、1(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化。
　　3.抗體制備。將純化后的蛋白作為免疫原免疫健康ICR小鼠，制備多克隆抗體，免疫印跡方法檢測抗體特異性。
　　4.抗APH0215抗體純化。將aph0215(77-144)克隆至原核表達(dá)載體pMAL-c5x，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并純化，得到MBP-APH0215作為抗原，免疫印跡方法檢測抗APH0215抗體的特異性。將純化的MBP-APH0215蛋

5、白偶聯(lián)至瓊脂糖凝膠，應(yīng)用親和層析方法純化抗APH0215多克隆抗體。
　　二．嗜吞噬細(xì)胞無形體T4SS潛在效應(yīng)分子APH0215的氨基酸序列分析及真核表達(dá)
　　1.應(yīng)用生物信息技術(shù)預(yù)測T4SS潛在效應(yīng)分子APH0215生物學(xué)活性和亞細(xì)胞定位等。2.分子克隆。根據(jù)APH0215基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得目的基因，克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-N1，獲得重組質(zhì)粒aph0215-pEGFP。
　　3.轉(zhuǎn)染和顯微鏡下觀察

6、。將aph0215-pEGFP轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察APH0215-GFP在細(xì)胞內(nèi)的分布及對細(xì)胞形態(tài)等其他方面造成的影響。
　　三．鑒定人粒細(xì)胞無形體病特異性新型診斷抗原
　　1.免疫印跡方法檢測 AP種屬特異性蛋白（APH0177-APH1127及 Ats-1）的抗原性。
　　2.應(yīng)用抗原性較強(qiáng)的APH0812與100份人血清樣本進(jìn)行免疫印跡分析，以已知的AP診斷抗原P44為對照，比較兩者的敏感性差異

7、。
　　結(jié)果：
　　一．嗜吞噬細(xì)胞無形體T4SS潛在效應(yīng)分子的篩選、原核表達(dá)及抗體制備
　　1.應(yīng)用生物信息技術(shù)，成功在AP基因組編碼的未知功能蛋白中篩選獲得35個T4SS潛在效應(yīng)分子，包括APH0177、APH0215、APH0248、APH0261、APH0615、APH0653、APH0812、APH1127。
　　2.成功將aph0177-aph1127及ats-1基因（aph0215除外）克隆至pET2

8、8a(+)原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測，分別在35.4 kDa、13.8 kDa、12.1 kDa、14.2 kDa、15.6 kDa、25.6 kDa、33.0 kDa和27.7 kDa出現(xiàn)明顯蛋白誘導(dǎo)條帶。將aph0215(90-144)和aph0215(77-144)兩條DNA片段成功克隆入pGEX-4T-1原核表達(dá)載體，并引入6×His標(biāo)簽，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在33.4 kDa和32 kDa處出現(xiàn)明顯蛋白

9、誘導(dǎo)條帶。
　　3.將上述克隆表達(dá)的蛋白用Ni瓊脂糖親和層析純化，免疫小鼠，制備多克隆抗體，經(jīng)免疫印跡檢測顯示，制備的抗體可與效應(yīng)分子特異性結(jié)合且效價較高。
　　4.成功構(gòu)建pMAL-aph0215原核表達(dá)載體，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在49.9 kDa處出現(xiàn)明顯蛋白誘導(dǎo)條帶，將其作為抗原檢測APH0215抗血清中抗體特異性，免疫印跡結(jié)果顯示，制備的APH0215抗體可與MBP-APH0215特異性結(jié)合。應(yīng)用瓊脂糖凝膠親和層析法純

10、化抗APH0215(77-144)抗體，結(jié)果顯示獲得的抗體特異性強(qiáng)且純度較高。
　　二．嗜吞噬細(xì)胞無形體T4SS潛在效應(yīng)分子APH0215的氨基酸序列分析及真核表達(dá)
　　1.生物信息學(xué)對APH0215氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示APH0215主要表達(dá)于溶酶體。
　　2.成功構(gòu)建真核表達(dá)載體 aph0215-pEGFP，轉(zhuǎn)染至 HeLa細(xì)胞后在熒光顯微鏡下觀察APH0215-GFP細(xì)胞內(nèi)的分布，結(jié)果顯示該蛋白聚集成顆粒狀

11、，在胞質(zhì)內(nèi)散在分布，且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。
　　三．鑒定人粒細(xì)胞無形體病特異性新型診斷抗原
　　1.免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)APH0653、APH0812和APH1127與AP陽性血清發(fā)生強(qiáng)烈的反應(yīng)，可作為候選HGA診斷抗原。
　　2.免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)P44和APH0812對人血清中的AP抗體呈現(xiàn)不同的敏感性。結(jié)論
　　1.成功構(gòu)建多個AP T4SS潛在效應(yīng)分子原核表達(dá)載體，并表達(dá)和純化，制備多克隆抗體，并對其中APH

12、0215多克隆抗體進(jìn)行純化，為效應(yīng)分子功能的研究奠定基礎(chǔ)和提供重要工具。
　　2.通過aph0215-pEGFP轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞模型，觀察APH0215在真核細(xì)胞內(nèi)的分布和對真核細(xì)胞形態(tài)的影響，為進(jìn)一步研究APH0215的生物學(xué)功能提供依據(jù)。
　　3.用獲得的多個嗜吞噬細(xì)胞無形體種屬特異性重組蛋白檢測 AP陽性標(biāo)本和臨床標(biāo)本，結(jié)果表明APH0812與P44聯(lián)合使用時可提高人粒細(xì)胞無形體病血清學(xué)檢測靈敏度，為AP新型診斷抗原鑒