青枯菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)Gsp蛋白互作分析.pdf

1、細菌通過設計精巧的蛋白傳輸系統(tǒng)，泌出毒性因子和效應子，與寄主進行分子交流。其中，Ⅱ型分泌系統(tǒng)廣泛存在于革蘭氏陰性細菌中。Ⅱ型分泌系統(tǒng)主要以分泌途徑轉膜蛋白(GSP)基因簇為中心。植物細菌性青枯病是我國和世界范圍內廣泛分布和發(fā)生的一種重要細菌病害，青枯菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)與致病蛋白的分泌密切相關。本研究利用酵母雙雜交技術，對青枯菌GMI1000菌株Ⅱ型分泌系統(tǒng)Gsp蛋白之間的互作關系進行了分析研究。 根據青枯菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)中12個gsp

2、基因的上下游序列，利用引物設計軟件，設計出12對最佳gsp基因擴增引物。克服了gsp基因GC％含量偏高(67.1-74.4％)、難以獲得擴增產物的困難，通過PCR體系條件優(yōu)化，成功地完成了青枯菌GMI1000菌株Ⅱ型分泌系統(tǒng)12個gsp基因的克隆。 分別將12個gsp基因連接到酵母雙雜交研究體系的誘餌載體pGBKT7及捕獲載體pGADT7上，成功地構建了gsp基因誘餌庫和捕獲庫。經過序列測定，證明12個gsp基因讀框正確，保障了

3、gsp基因在酵母體系中正確的表達。 成功地將誘餌庫和捕獲庫共轉化到AH109酵母菌株中，發(fā)現(xiàn)在酵母雙雜交體系中，GspL和GspE；GspL和GspM；GspG和GspE；GspC和GspL及GspⅠ和GspJ蛋白之間可能存在相互作用。經載體互換后，證實了GspL和GspE；GspL和GspM；GspG和GspE蛋白之間互作的真實性。 本研究首次將酵母雙雜交技術引入到青枯菌Ⅱ型分泌系統(tǒng)Gsp蛋白的互作研究中，實驗得到了三