嗜水氣單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)AscV基因突變株的構建及外膜蛋白的研究.pdf

1、　　致病性嗜水氣單胞菌(Ah)是我國淡水養(yǎng)殖魚類的重要病原之一，研究其毒力因子對了解該菌的致病機制具有重要的意義。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(TTSS)與動植物的許多革蘭氏陰性病原菌的毒力因子的分泌有關。本研究從嗜水氣單胞菌J-1株中克隆出Ⅲ型分泌系統(tǒng)AscV基因，成功構建了其缺失突變株；另外對嗜水氣單胞菌的外膜蛋白OMPⅡ進行了研究?！　「鶕寻l(fā)表的嗜水氣單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)AscV基因的核苷酸序列，設計并合成了一對引物，以嗜水氣單胞菌AhJ-1株

2、的基因組DNA為模板，通過PCR技術，擴增出一段大小約為710bp的核苷酸片段。將該片段克隆至質粒載體pMD18-T中，隨后進行測序及序列分析。結果表明：擴增出的基因片段與嗜水氣單胞菌AH3株Ⅲ型分泌系統(tǒng)中的AscV基因有96﹪的同源性，與殺鮭氣單胞菌的同源性為86﹪，與溫和氣單胞菌的同源性為85﹪。在檢測的39株嗜水氣單胞菌中，37株致病菌都擴增出目的片段，而另外2株非致病菌沒有目的片段擴出，推測AscV基因為致病菌株所特有。　　將

3、含有卡那霉素抗性(Kmr)基因的自殺性質粒pJP5603及連入T載體的AscV基因PCR產物用EcoRⅠ與PstⅠ雙酶切后，回收3.0Kb與713bp的目的片段，連接后轉化感受態(tài)細胞cc118λpir，利用Kmr進行篩選，獲得的克隆經EcoRⅠ與PstⅠ雙酶切及PCR鑒定，確定得到重組質粒，命名為pYYAscV。將重組質粒轉化感受態(tài)細菌J-1株，篩選到的克隆經PCR鑒定，得到1個突變株，命名為AhJ-1△AscV。同時研究了該突變株的主

4、要特性，與親本株相比，其胞外蛋白酶、淀粉酶以及溶血素均檢測不到?！　「鶕呀洶l(fā)表的外膜蛋白基因porinⅡ的核苷酸序列，設計一對特異性引物，以本實驗中的18株嗜水氣單胞菌的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，結果表明，有¨株擴增出1008bp的目的片段。用十二烷基肌胺酸鈉抽提結合高速離心純化，制備了18株嗜水氣單胞菌的主要外膜蛋白(MOMP)。經SDS-PAGE圖譜發(fā)現(xiàn)，porinⅡ基因檢測為陽性的菌株具有39kD的蛋白條帶，進一步用