野油菜黃單胞菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)突變及表型分析.pdf

1、在革蘭氏陰性細(xì)菌中，跨膜的大分子物質(zhì)的分泌主要是由不同的蛋白分子構(gòu)成的分泌系統(tǒng)進(jìn)行，這些分泌系統(tǒng)可以將毒力因子通過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞膜分泌到胞外。Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system，T4SS)是分泌蛋白質(zhì)的六種主要分泌系統(tǒng)之一。T4SS在幾種重要的動(dòng)物及人體病原細(xì)菌中扮演著重要的角色，在植物病原細(xì)菌中與根癌農(nóng)桿菌的致病性息息相關(guān)。野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestris pv.camp

2、estris，Xcc)是一種能在全球范圍內(nèi)引起所有十字花科植物黑腐病的重要病原細(xì)菌。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在野油菜黃單胞菌中也存在T4SS，但T4SS與野油菜黃單胞菌的致病性是否相關(guān)仍不清楚。為了明確T4SS在野油菜黃單胞菌中是否和致病相關(guān)，本研究以Xcc菌株8004為材料，進(jìn)行了T4SS基因簇的缺失突變體構(gòu)建，然后對(duì)突變體的表型和致病性進(jìn)行了有關(guān)的檢測(cè)。 利用DNA分子操作技術(shù)進(jìn)行缺失突變體的構(gòu)建。根據(jù)Ⅳ型分泌系統(tǒng)VirB/D4基

3、因簇在Xcc 8004基因組中的位置和序列，設(shè)計(jì)獲得Ⅳ型分泌系統(tǒng)左側(cè)、右側(cè)各一對(duì)引物，并通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得T4SS左右兩側(cè)DNA片段，大小分別為1044bp(T4-L)、938bp(T4-R)。以pPH1JI質(zhì)粒為模板，Gm-F/Gm-R為引物，PCR擴(kuò)增獲得了Gm抗性基因片段，大小為826bp。將上述三片段連接至自殺質(zhì)粒pk18mobsacB，通過(guò)轉(zhuǎn)化篩選獲得重組質(zhì)粒pk18mobsacB::T4。將該重組質(zhì)粒通過(guò)三親本接合導(dǎo)入Xcc

4、 8004，獲得Xcc8004的T4SS缺失突變體8004△T4SS，PCR驗(yàn)證構(gòu)建正確。 利用常規(guī)方法進(jìn)行T4SS缺失突變體的表型檢測(cè)。致病相關(guān)生化因子表型分析結(jié)果表明，該突變體的胞外多糖產(chǎn)量沒(méi)有明顯變化，胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外纖維素酶的活力也未受到明顯影響：突變體的游動(dòng)性沒(méi)有明顯變化；在豐富培養(yǎng)基(NYGB)和基本培養(yǎng)基(MMX)上，突變菌株與野生型菌株的生長(zhǎng)繁殖能力一樣。在寄主植物上用剪葉接種與噴霧接種法進(jìn)行致病性檢