野油菜黃單胞菌xanA基因的克隆與表達.pdf

1、當前，各種新類型的微生物多糖不斷出現(xiàn)，但黃原膠卻是世界范圍內(nèi)唯一在多種行業(yè)中得到廣泛應用的具有重大商業(yè)價值的微生物多糖。它是以玉米淀粉為主要原料而產(chǎn)生的一種高分子量的雜聚糖。因其獨特的分子結(jié)構(gòu)，因而具有獨特的流變性、良好的水溶性、對熱酸堿的穩(wěn)定性等許多優(yōu)異的物理化學性能，已被廣泛應用于食品、飲料、化妝品、洗滌劑、陶瓷、石油開采、化工涂料、森林滅火等三十多種行業(yè)。采用基因技術(shù)改造植物、微生物，在當前的時代已不是高不可測的尖端技術(shù)。隨著基因

2、技術(shù)的發(fā)展，針對黃原膠產(chǎn)率的研究也由菌種選育、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件等轉(zhuǎn)向基礎(chǔ)代謝流、基因工程和酶工程方面的研究。 本文主要研究了以下幾方面內(nèi)容： 1.對野油菜黃單胞菌的主要生物學特性和黃原膠的生物合成途徑，以及黃單胞菌分子生物學方面基礎(chǔ)知識進行了研究。通過研究選擇了表達在合成途徑中具有重要作用的磷酸葡萄糖變位酶基因--產(chǎn)膠基因xanA，作為克隆的目標；隨后利用Genebank對產(chǎn)膠基因xanA進行了序列分析，并對該段基因表達

3、的磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的性能和氨基酸序列進行了研究。 2.采用比較普遍的CaCl<,2>法進行大腸桿菌感受態(tài)的制備。比較了使用0.1mol/l CaCl<,2>試劑和0.1mol/l的CaCl<,2>：MgCl<,2>=4:1的溶液兩種不同方法制備的大腸桿菌DH5α和JM109感受態(tài)細胞的效果，發(fā)現(xiàn)使用后者能有效地提高感受態(tài)細胞的吸收能力，使重組細胞的構(gòu)建成功率更高。 3.通過斯坦福大學的在線引物設計程序，以GeneBank

4、中公布的野油菜黃單胞菌xanA基因序列(AF204145.1)為模版，設計出了六對引物，從中選擇了一對最優(yōu)的引物，通過梯度PCR比較了三種不同溫度對產(chǎn)膠基因xanA克隆效果的影響；得出的結(jié)論為，PCR的最適溫度為56℃。 4. 利用pUCm-T載體的特性，將回收的目的條帶與pUCm-T載體直接進行連接。在連接過程中比較了兩種連接方法對重組克隆質(zhì)粒形成的影響，得出了16℃連接過夜的最優(yōu)連接條件，得到了含有產(chǎn)膠基因.xanA的重組克

5、隆質(zhì)粒pUCm-T-xanA。 5.通過轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109成功構(gòu)建了含有產(chǎn)膠基因.xanA的克隆質(zhì)粒pUCm-T-xanA大腸桿菌細胞，進行藍白斑篩選和假陽性篩選，最終成功獲得了重組細胞JM109-T-xanA。對得到的重組細胞進行了測序和序列分析，結(jié)果證明了克隆結(jié)果的正確性。 6.利用表達質(zhì)粒pET28b，通過對重組克隆質(zhì)粒的抽提、酶切，構(gòu)建了含有產(chǎn)膠基因xanA的表達質(zhì)粒pET28b-xanA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21

6、，通過氨芐青霉毒抗性篩選和菌落PCR篩選得到了陽性克隆細胞BL21-28b-xanA，隨后對重組細胞并進行了測序和序列分析，結(jié)果表明表達載體構(gòu)建成功。 7.利用pET28b和BL21的表達系統(tǒng)，使用一定濃度的IPTG試劑誘導重組細胞BL21-28b-xanA，表達出了磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(PGM)。通過SDS-DAGE鑒定了表達產(chǎn)物的分子量，又進一步通過紫外分光光度計法對表達產(chǎn)物進行了酶活的測定。結(jié)果表明磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶有表達，但是