黃顙魚溫和氣單胞菌的特性研究及溶血素基因的克隆與表達(dá).pdf

1、溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)，又稱威隆氣單胞菌溫和生物型(A．veronii bv．sobria)，是危害我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的重要病原菌之一，能引起魚類、爬行類、兩棲類等冷血動物的出血性敗血癥，同時，該菌也是重要的人畜共患病的病原菌，能引發(fā)腹瀉、傷口感染和敗血癥等癥狀。研究報道顯示，溫和氣單胞菌廣泛存在于水域、土壤及水生動物體內(nèi)，是一種條件性致病菌，其主要致病因子是溫和氣單胞菌產(chǎn)生的多種溶血素和腸毒素，這些毒素具有多種生

2、物活性，可引起動物體發(fā)生復(fù)雜的病理變化。 目前尚未見有關(guān)于黃顙魚患溫和氣單胞菌的報道，本試驗對發(fā)病后死亡的黃顙魚體內(nèi)分離的致病性病原菌進(jìn)行了生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，同時進(jìn)行生物學(xué)特性研究和致病性試驗及藥敏試驗，并對其主要的致病因子溶血素基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)。 1、黃顙魚分離病原菌的鑒定 從患病死亡后的黃顙魚體內(nèi)分離并純化后，獲得兩株病原菌RC—07—KA和RC—07—XB，通過對病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生理

3、生化特征等進(jìn)行試驗，并通過弧菌科細(xì)菌生化鑒定編碼(GY-9V)系統(tǒng)鑒定方法，將分離菌株鑒定為溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)。通過對基因組16S rRNA基因擴(kuò)增，擴(kuò)增出分離菌株16S rRNA基因1431bp的基因片段，序列分析結(jié)果表明，分離菌株的16S rRNA基因核苷酸序列與Genbank上報道的溫和氣單胞菌的16S rRNA基因序列親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)97％以上。 2、溫和氣單胞菌分離菌株的生物學(xué)特性

4、研究 本試驗用黃顙魚分離菌株RC—07—KA對鯽魚和黃顙魚進(jìn)行致病性試驗，并將分離菌株在不同的pH值和溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，以篩選出分離菌株生長的最適pH值和溫度。用20種抗生素和6種常用的消毒劑對分離菌株進(jìn)行了藥物敏感性測定。結(jié)果顯示：溫和氣單胞菌分離菌株對鯽魚和黃顙魚都有較強(qiáng)的致病力，對鯽魚的最小致死量為1.7×107CFU，對黃顙魚的最小致死量為1.95×106CFU，分離菌株生長的最適pH范圍在7.0～7.5之間，其最適生

5、長溫度在30℃左右。藥物敏感試驗表明丁胺卡拉霉素、丙氟哌酸、氧哌嗪青霉素、先鋒霉素、卡拉霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素等藥物抑菌效果最佳；幾種消毒劑對該菌都有明顯的抑菌作用，尤其是甲醛、戊二醛和癸甲溴銨等對該菌具有較強(qiáng)的殺滅效果。 3、溫和氣單胞菌分離菌株溶血素基因片段的克隆與表達(dá) 根據(jù)GeneBank公布的人源性溫和氣單胞菌的溶血素(hly)基因序列，設(shè)計含BamHI和HindⅢ位點(diǎn)的引物，以黃顙魚分離菌株的基因組DNA為

6、模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hly基因片段克隆到pMD19—T載體上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pMT—hly，并比較擴(kuò)增的溶血素基因序列的同源性，然后將該基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX—KG，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pMT—GEX—hly，轉(zhuǎn)化BL21并進(jìn)行SDS—PAGE分析。結(jié)果顯示：PCR擴(kuò)增出分離菌株溶血素基因一條長度為830bp的結(jié)構(gòu)基因片段，克隆的hly基因與GenBank報道的溶血素基因同源性達(dá)98％；重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)出約5