耐藥嗜水氣單胞菌的外膜結構和免疫原性變化的初步研究.pdf

1、本研究從自然條件下發(fā)病的瀕死魚體內(nèi)分離篩選到6株對四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物敏感的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)，采用次抑菌濃度傳代培養(yǎng)方法，人工誘導分別得到耐鹽酸四環(huán)素、耐鹽酸多西環(huán)素、耐諾氟沙星和耐左氧氟沙星的A． hydrophila菌株，分析敏感和耐藥A. hydrophila外膜中主要保護性抗原脂多糖和外膜蛋白的SDS-PAGE電泳條帶差異，初步探討了A． hydrophila耐四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物

2、的多重耐藥機制。制備敏感菌和人工誘導獲得的耐藥突變A. hydrophila的外膜蛋白、脂多糖和福爾馬林滅活全菌疫苗，分別腹腔注射免疫接種斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus Rafinsque），探討敏感菌和耐藥菌苗的免疫效果差異，初步闡明了A． hydrophila耐藥性變化和抗原性變化的關系，為耐藥菌的成分疫苗及防治藥物研究奠定理論基礎，為耐藥菌的防治提供新的思路。研究結果如下：
　　 1．獲得6株致病性的A

3、. hydrophila。其編號分別為Ah638、Ah640、Ah563、Ah541、Ah15和Ah28。參照依日本化學療法學會制定的標準法測定試驗藥物對菌株的最小抑菌濃度(MIC)，并查找MIC解釋標準，結果表明除了Ah563、Ah638、Ah28和Ah15對鹽酸四環(huán)素為中介菌外，6株A. hydrophila菌株對鹽酸多西環(huán)素、諾氟沙星和左氧氟沙星均敏感，Ah541和Ah640對鹽酸四環(huán)素也敏感，同時氟喹諾酮類藥物的抑菌效果比四環(huán)素

4、類藥物強，尤其是左氧氟沙星的抑菌能力特別強。
　　 2．在28℃條件下培養(yǎng)72h為1代，分別在含有鹽酸多西環(huán)素、鹽酸四環(huán)素、諾氟沙星和左氧氟沙星的藥物培養(yǎng)基中連續(xù)傳代9次后，四環(huán)素類對3個菌株的MIC上升倍數(shù)為8～32倍，氟喹諾酮類藥物組MIC上升倍數(shù)為125～7997倍，且耐藥獲得后保持穩(wěn)定。同時A.hydrophila對四環(huán)素類和氟喹諾酮類藥物存在交叉耐藥。耐藥菌4℃保存10d和20d耐藥性保持穩(wěn)定，30d耐藥性均有不同程度

5、的下降。
　　 3．通過比較敏感菌與耐藥菌外膜蛋白和脂多糖的SDS-PAGE電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)所有耐藥A． hydrophila的外膜蛋白片段均發(fā)生改變，不同菌株改變情況略微不同。和敏感菌相比，耐藥菌有的外膜蛋白條帶(42.6kD)表達上升，有的外膜蛋白條帶表達減少（36.6kD、27.7kD和22.2kD）。研究發(fā)現(xiàn)耐藥A． hydrophila的脂多糖電泳圖譜均顯示快速遷移條帶表達密度降低，耐藥性上升倍數(shù)更大的左氧氟沙星耐藥菌則

6、顯示快速遷移條帶遷移表達密度降低更多，蛋白酶K消化組顯示條帶密度更低，高水平耐藥的諾氟沙星耐藥菌（MIC200μg/mL）的脂多糖快速遷移條帶遷移的更遠。
　　 4．斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus Rafinsque)經(jīng)腹腔注射免疫接種諾氟沙星敏感菌和人工誘導耐藥菌的3種疫苗后，均能產(chǎn)生較強的免疫應答，所有受免魚血清凝集抗體效價和交叉凝集抗體效價、溶菌酶活性、血液吞噬細胞的吞噬活性均顯著高于無菌生理鹽水對照組