序貫注射太空鏈球菌對S180荷瘤小鼠腫瘤細胞多糖分子表達影響的研究.pdf

1、1.背景 乙型鏈球菌制劑在臨床上的應用也表明有明顯的抗瘤和提高免疫力作用。早在1967年日本學者Okamoto的研究證明：鏈球菌的抗腫瘤活性主要是由該菌產(chǎn)生的S溶血素所致，并證明溶血性鏈球菌對多種移植性動物腫瘤均有殺傷作用，包括艾氏腹水癌、S180、S37、Bron-pearce癌、Krebs-2癌、Yoshida腹水肉瘤、纖維瘤、淋巴性白血?。⊿N36、L4946）、腹水性肝癌（AH-130、AH-66）[1]。與癌細胞接觸，

2、能直接破壞癌細胞RNA轉錄過程，使癌細胞膨脹空泡化及崩潰壞死。此外還能啟動細胞及體液免疫，使腫瘤壞死因子、干擾素、白介素等細胞因子水平顯著提高，從而包圍浸潤和附著在腫瘤細胞上，使之變性壞死，癌細胞減少，從而控制腫瘤生長。因此，溶血性鏈球菌制劑通過直接殺傷腫瘤細胞和激活機體免疫系統(tǒng)非特異性殺傷腫瘤細胞，既是抗腫瘤藥物也可以免疫調(diào)節(jié)劑[2]。根據(jù)該原理研制并生產(chǎn)OK-432β-溶血性鏈球菌抗腫瘤生物制劑。該藥在日本已廣泛用于腫瘤的輔助治療，

3、是一種細菌免疫強誘導劑，溶血性鏈球菌高效低毒菌株SIPI722經(jīng)青霉素等處理后制成的凍干粉針劑。我國同類制劑（商品名：沙培林）也在腫瘤臨床廣泛使用， 近十多年來，我國載人航天科技發(fā)展迅猛，使得運用載人航天飛船的空間技術條件進行微生物太空誘變（Space Mutation）育種是培育生物新菌種成為現(xiàn)實。其原理是通過外層空間特殊的物理化學環(huán)境，即微重力、宇宙輻射、高能粒子、交變磁場及超潔凈等環(huán)境中，引起菌種DNA分子的變異和重組，菌

4、種遺傳性狀發(fā)生改變，從而獲得生命力旺盛、生長速度快、代謝產(chǎn)物獲得率高、品質(zhì)優(yōu)良并可穩(wěn)定遺傳的高產(chǎn)高效菌種。將溶血鏈球菌D33#連續(xù)多次搭載“神舟”系列飛船和返回式科學與技術實驗衛(wèi)星，使之遨游太空實現(xiàn)了誘變，最終獲得高產(chǎn)高效、有自主知識產(chǎn)權的創(chuàng)新型菌株溶血鏈球菌T33#。注射用多抗甲素（甘露聚糖肽）在我國臨床已經(jīng)廣泛應用于抗腫瘤治療療效顯著。該藥為溶血性鏈球菌33#菌株繹深層提煉而成的其免疫活性的a-甘露聚糖肽類物質(zhì)，對S180肉瘤有抑制

5、作用，抑小鼠艾氏腹水癌DNA合成，增加小鼠腹網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力及淋巴細胞轉化功能，促胸腺淋巴細胞代謝，拮抗CTX對機體的免疫抑制作用。用免疫增強劑。具有增強機體免疫功能和激活吞噬細胞、升高外周白細胞的作用；能提高骨髓造血機能和機體應激能力。 眾所周知，生物細胞及血液中存在糖復合物。糖鏈是繼蛋白質(zhì)、核酸之后的第三條生命鏈。復合物作為一類生物性物質(zhì)，廣泛存在于人體內(nèi)，愈來愈多的研究表明，糖復合物是體內(nèi)重要的信息分子，在細胞的分化

6、、信號的傳導、分子的識別等許多生命活動中起著十分重要的作用。糖復合物中的寡鏈是分子間及細胞間識別的標志。通過這種識別作用，許許多多的生物反應被啟動了。 在正常情況下，各種糖鏈表達的水平是相對穩(wěn)定的。當細胞出現(xiàn)惡變，糖鏈的性質(zhì)及數(shù)量都會發(fā)生一系列變化，并可以反映在于凝集素的結合能力上。凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動物和高等動物中提純的糖蛋白或結合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），故名凝集素。凝集素是一類

7、天然的免疫原性、能識別糖鏈結構的蛋白質(zhì)，其與糖表現(xiàn)出專一性的結合，類似抗原抗體特異性結合。利用凝集素的這種天然特性，可將其作為探針檢測腫瘤細胞表面、細胞內(nèi)和血清中多糖水平。糖在目前的臨床診療當中有著重要的作用。根據(jù)凝集素與糖的這個特異性結合，可以將其分為7大類：（1）D-甘露糖（D——葡萄糖）組；（2）N——乙酰葡萄糖胺組；（3）乙酰半乳糖胺組；（4）D——半乳糖組；（5）L——巖澡糖組；（6）唾液酸組；（7）復合糖組。各類凝集素相關多

8、糖分子和腫瘤的發(fā)病及診療均有較密切的關系。當腫瘤出現(xiàn)時，糖復合物與凝集素結合會發(fā)生改變，而且腫瘤細胞伴有細胞膜的改變，細胞膜上的糖基也會產(chǎn)生相應的變化，可用凝集素檢測出來。大量研究發(fā)現(xiàn)，凝集素可作為腫瘤組織源性的標記、腫瘤特異性診斷的標志、腫瘤惡性的標記和不同腫瘤的分化標記[13]。 2.目的 在不同種類的凝集素中選取五種有代表性的凝集素，分別是刀豆凝集素（ConA）、麥胚凝集素（WGA）、接骨木凝集素（SNA）、蓖麻凝

9、集素Ⅰ（RCAⅠ）、植物血凝（PHA）。利用凝集素與糖特異性結合的特性研究注射鏈球菌制劑對S180荷瘤小鼠腫瘤細胞N-高甘露糖型、末端GlcNAc、末端Neu5Aca2-6Gal、末端Gaiβ1-4GlcNAc及Gal-NAC多糖分子表達變化的情況；觀察經(jīng)序貫注射后腫瘤生長情況；探討鏈球菌制劑抑瘤率與糖鏈表達水平的關系。 3.方法 3.1.建立動物模型：隨機分成4組，①②③④每組10只。1）先將①②組小鼠進行全身免疫，方

10、法：腹腔內(nèi)注射鏈球菌制劑（注射劑量均為0.1mg）。而③④組則腹腔內(nèi)注射生理鹽水；2）約一周后將4組小鼠均予皮下接種S180肉瘤細胞，約兩周后長出直徑約1cm的腫瘤；3）取出組①（腹腔注射鏈球菌制劑2組其中1組）以及組③（腹腔注射生理鹽水2組的其中1組），在瘤內(nèi)直接注射相同劑量的鏈球菌制劑，剩余2組②④注射生理鹽水。經(jīng)上述處理一周后，將小鼠處死取出腫瘤組織，分離出單個細胞懸液，用PBS緩沖溶液將其調(diào)整成相同濃度100毫克/ml，予超聲波

11、破碎腫瘤細胞，取其上清液。收集后于-70℃存放，待檢。 3.2.帶辣根過氧化物酶標記的凝集素制備：通過改良過典酸鈉法將兩者偶聯(lián)[30]。檢查酶標凝集素結合率及效價。 3.3.樣品收集及處理：S180肉瘤細胞樣品行超聲破碎，反復凍融后，在超聲破碎儀破碎。按超聲說明，將肉瘤細胞和PBS混合，并把濃度調(diào)整到每個樣品為100毫克/ml（通過顯微鏡檢，細胞數(shù)大約為7×108個/ml）功率：800W，總時間：4分鐘/樣品，破碎時間：

12、2分鐘（開5秒，關5秒）。根據(jù)公式：細胞相對破碎率=（1-超聲后細胞沉淀濕重/超聲前細胞沉淀濕重）%，計算出破碎率達98.7%。取上清液，離心20min（12000r/s），得澄清液在-20℃冰箱保存待測。 3.4.凝集素識別多糖分子的檢測：將樣品按以上的最適宜濃度包被96孔ELISA板上，每孔100μl，4℃過夜，PBS緩沖液洗1次，分別加入檢血清100μl，4℃反應4h，PBS洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的糖蛋白，每孔10

13、0μl，4℃反應4h，PBS洗3次，TMB2H2O2顯色10min，中止反應后，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長450nm OD的值。計算抑瘤率：[模型組瘤重-實驗組瘤重]/模型組瘤重[28]。 3.5.實驗對照：取破碎小鼠紅細胞的上清液代替待測樣品作陽性對照；用PBS代替檢測血清做陰性對照；其他步驟不變。 3.6.統(tǒng)計學數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。 4.結果 4.1.計算抑瘤率計算聯(lián)合給藥治療組、全身給

14、藥治療組、局部給藥治療組的抑瘤率分別：35.1%、8.8%、19.9%。結果提示：聯(lián)合給藥組較全身給藥組及局部給藥組的抗瘤效應顯著。 4.2.制備ConA-HRP/WAG-HRP/SNA-HRP/PHA-HRP/RCA1-HRP。標記率分別為0.73、0.78、0.75、0.70、0.71。以ELISA法檢測效價均為1：1000。 4.3.各種小鼠腫瘤細胞ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1識別的相關多糖分子含量

15、OD值： 聯(lián)合給藥治療組樣品ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1識別的多糖分子含量OD值分另11：1.306±0.020、1.313±0.033、1.259±0.031、1.255±0.021、1.251±0.028 全身給藥組治療分別：1.856±0.025、1.737±0.033、1.444±0.028、1.669±0.035、1.566±0.035 局部給藥組治療分別：1.362±0.024、1.3

16、84±0.033、1.386±0.025、1.346±0.033、1.417±0.031 陰性對照組分別：1.952±0.024、1.764±0.032、1.534±0.025、1.802±0.034、1.689±0.030 以上結果輸入SPSS13.0作析因分析，（腹腔內(nèi)注射及瘤內(nèi)注射）主效應均有顯著統(tǒng)計學差異A腹腔注射鏈球菌P=0.000；B瘤內(nèi)注射鏈球菌P=0.000，可以認為腹腔內(nèi)注射鏈球菌及瘤內(nèi)注射鏈球菌均能使

17、ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1相關多糖分子表達含量降低；五種相關多糖兩因素有交互作用，腹腔內(nèi)及瘤內(nèi)均注射（序貫給藥）太空鏈球菌時，ConA/WAG/SNA/PHA/RCA-1相關多糖分子表達含量降低最顯著。 5.結論 5.1.先全身給藥后局部給藥的序貫給藥治療方法對小鼠S180肉瘤的生長的影響經(jīng)析因分析兩因素有交互效應，腹腔內(nèi)注射免疫小鼠對瘤內(nèi)注射有增效作用，表明S180荷瘤小鼠的序貫免疫注射太空鏈球菌制劑