注射和浸泡免疫疫苗后牙鲆免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化研究.pdf

1、免疫接種疫苗是防治魚類細(xì)菌性、病毒性疾病的有效方法。目前,疫苗免疫方式主要以注射、浸泡等方法為主,對于免疫效果的評價(jià)則除了通過魚類血清及黏液抗體水平變化、酶(超氧化物歧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶等)活、淋巴細(xì)胞數(shù)量、吞噬作用、補(bǔ)體活性等指標(biāo)來判定外,從基因水平對疫苗免疫效果進(jìn)行研究也越來越受到關(guān)注。本論文利用實(shí)驗(yàn)室保存的鰻弧菌(Vibrio anguillarum)菌種,制備了福爾馬林全菌滅活疫苗,采用注射和浸泡兩種方式分別免疫牙鲆,應(yīng)用

2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測了免疫后牙鲆17種免疫相關(guān)基因表達(dá)的變化。論文主要內(nèi)容如下:
　　實(shí)驗(yàn)將健康牙鲆分為四組,每組60尾,第一組浸泡于濃度為1×108CFU/mL滅活疫苗菌液中,連續(xù)充氣浸泡30min;第二組浸泡于海水中30min,作為浸泡組對照;第三組腹腔注射濃度為1×108CFU/mL的鰻弧菌滅活疫苗,每尾0.1mL;第四組腹腔注射0.1mLPBS,作為注射組對照。于免疫后0h、4h、8h、12h、24h、48h、72h、

3、96h、7d、14d十個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣,每組取5尾,分別剪取牙鲆脾臟、頭腎和鰓3種組織,提取總mRNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)各基因特異性引物,以18sRNA為內(nèi)參,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測3種組織中Toll-like受體(TLR)2、TLR5M、髓樣分化因子MyD88、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、白介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)α、干擾素(IFN)γ、趨化因子CXC、主要組織相容性復(fù)

4、合體(MHC)Ⅰ、MHCⅡ、T細(xì)胞表面受體CD4、T細(xì)胞表面受體CD8、免疫球蛋白(Ig)M、補(bǔ)體C3、c型溶菌酶、熱休克蛋白(HSP)-70十七種免疫相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果顯示,兩種方式免疫后,除TLR5M表達(dá)在脾臟和頭腎中無顯著變化外,各基因表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上調(diào)。注射組,三種組織中,TLR2、MyD88、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNFα、IFNγ、CXC、C3、c型溶菌酶和HSP7011種基因的表達(dá)高峰出現(xiàn)時(shí)間在

5、12-24h,其中,TLR2、MyD88、NF-κB、CXC、C3在鰓中的表達(dá)高峰出現(xiàn)較遲,在48-72h;而三種組織中MHCⅠ、MHCⅡ、CD4和CD84種基因的表達(dá)高峰在出現(xiàn)在48-72h,IgM的表達(dá)高峰出現(xiàn)在7d,各基因表達(dá)最高值是對照組的2-70倍;浸泡組,三種組織中,TLR2、MyD88、NF-κB、IL-1β、IL-6、TNFα、IFNγ、CXC、C3、c型溶菌酶和HSP7011種基因的表達(dá)高峰出現(xiàn)在12-48h,MHCⅠ

6、、MHCⅡ、CD8表達(dá)高峰出現(xiàn)在48-96h,但CD4在頭腎和鰓中表達(dá)高峰出現(xiàn)在72h,在脾中表達(dá)高峰出現(xiàn)在7d,IgM在鰓中表達(dá)高峰出現(xiàn)在96h,在脾和頭腎中表達(dá)量在14d內(nèi)逐漸上升,各基因表達(dá)最高值是對照組的2-20倍。結(jié)果表明,注射組各組織幾乎所有基因的轉(zhuǎn)錄水平均高于浸泡組,且脾臟、頭腎中最高值出現(xiàn)時(shí)間早于浸泡組,但鰓中各基因峰值出現(xiàn)時(shí)間與浸泡組相同或晚于浸泡組。研究結(jié)果豐富了免疫相關(guān)基因的分子研究,為疫苗的免疫途徑及免疫效果評價(jià)