牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔稚幼魚腸道菌群結構變化及定植規(guī)律研究.pdf

1、本文研究了工廠化人工育苗條件下牙鲆(Paralichthys olivaceus)仔稚幼魚腸道菌群結構變化及定植規(guī)律，并分析了牙鲆仔稚幼魚腸道菌群結構與餌料和水環(huán)境中菌群的關系，以及探討了腸道菌群形成機制，旨在為牙鲆人工育苗和養(yǎng)殖過程中腸道生理健康標準提供理論依據(jù)。主要研究結果如下：
　　1.采用MiSeq16S rRNA高通量測序技術和生物信息學分析方法，構建牙鲆工廠化人工育苗模式下仔稚幼魚階段6個不同時期16S rRNA基因測

2、序文庫，共獲得7462個OTU，42個菌門，972個菌屬。初孵仔魚G1樣品中變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要優(yōu)勢菌，相對豐度分別為55.20％、13.37%和21.58%；9日齡G2和21日齡G3腸道的優(yōu)勢菌群結構較單一，變形菌門（＞90%）成為此時期腸道的絕對優(yōu)勢菌群；45日齡后，變形菌門的相對豐度顯著降低，厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度明顯增大，成

3、為腸道菌群的優(yōu)勢菌群。屬水平上，仔稚幼魚腸道優(yōu)勢菌群的種類和數(shù)量都發(fā)生了較大變化，在9日齡和21日齡時期變形菌門中的弧菌屬（Vibrio）相對豐度最高，到45日齡時期后其相對豐度銳減到最低水平；在80日齡時期，擬桿菌門中的擬桿菌屬（Bacteroides）和普氏菌屬（Prevotella）相對豐度達到較高水平，成為腸道優(yōu)勢菌屬；在115日齡時期，厚壁菌門中有8個菌屬均發(fā)展成為優(yōu)勢菌屬。
　　2.通過16S rRNA高通量測序分析，

4、探明了牙鲆工廠化人工育苗餌料系列中各種餌料樣品微生物菌群結構特征及其與仔稚幼魚菌群結構的關系。輪蟲餌料F2中變形菌門（78.21%）和擬桿菌門（13.33%）最多，而厚壁菌門(2.28%)和藍藻菌門（Cyanobacterium）(1.47%)的相對豐度很低；共有14個優(yōu)勢菌屬。鹵蟲餌料 F3中的優(yōu)勢菌為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，三者 OTU相對豐度之和大于98.26%；11個優(yōu)勢菌屬中弧菌屬（28.34%）和假交替單胞菌屬（12.

5、36%）的相對豐度最高；輪蟲和鹵蟲兩種活生物餌料的優(yōu)勢菌屬差異明顯，僅假交替單胞菌屬和紅桿菌屬（Rhodobacter）為共有優(yōu)勢菌屬。配合飼料F4中的優(yōu)勢菌屬分布較為均勻，共有12個，大多屬于厚壁菌門芽孢桿菌綱，其中乳球菌屬（Lactococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棲熱菌屬（Thermus）三者相對豐度最高，均大于6%。配合飼料 F5中的優(yōu)勢菌屬為腐敗希瓦菌屬（Shewanella）、嗜冷桿菌屬（Psyc

6、hrobacter）和不動桿菌屬（Acinetobacter），與F4相比差別較大；配合飼料F6中藍藻菌門的豐度達到最高為74%，成為絕對優(yōu)勢菌屬。
　　水體樣品的菌群結構在門分類水平上變化不大，優(yōu)勢菌群都是變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門，但是各時期樣品優(yōu)勢菌屬變化明顯。1日齡W1樣品中菌群多樣性豐富，有14個優(yōu)勢菌屬；9日齡W2樣品中，變形菌門是絕對優(yōu)勢菌群，擬桿菌門中的黃桿菌目（Flavobacteriales）的相對豐度增加到

7、32.4%，厚壁菌門中的乳球桿菌的豐度增加到1.96%，成為優(yōu)勢菌屬；21日齡W3樣品中擬桿菌門中的優(yōu)勢菌相對豐度降低，而γ-變形菌門的總豐度高達73.45%，其中，弧菌屬和假交替單胞菌屬的相對豐度最高，分別為20.7%和13.7%；45日齡W4樣品中黃桿菌目的相對豐度約為17.34%，但優(yōu)勢菌的種類減少到2個；80日齡水體W5中優(yōu)勢菌屬的種類減少，而優(yōu)勢菌的相對豐度增加，其中γ-變形菌中的假交替單胞菌屬的相對豐度達到38.94%；11

8、5日齡 W6中除了乳球菌屬的相對豐度增加成為優(yōu)勢菌屬，菌群結構變化不大，與W5時期組成相似。
　　3.對6個取樣階段餌料、水與腸道樣品菌群的相似關系分析。牙鲆在攝食活餌料輪蟲和鹵蟲階段，腸道菌群與餌料的相似性較高，分別為17.61%、41.11%；在轉換配合飼料后，腸道菌群與配合飼料的菌群相似性逐漸降低，115日齡時，與餌料的相似性僅為3.34%，而且共有優(yōu)勢菌屬消失。初孵仔魚樣品與水體菌群的相似性最高為26.77%，共有優(yōu)勢菌屬

9、3個；在開口后9日齡至80日齡的4個時期，腸道菌群與水體菌群的相似性均在7%左右；115日齡時腸道菌群與水體菌群的相似性降到1.15%，而且兩者沒有共同的優(yōu)勢菌屬存在。對腸道與餌料樣品、腸道與水體樣品進行 RELATE分析，結果顯示腸道菌群與餌料之間的相關性（ Spearman correlation Rho0.588，P＜0.05）遠高于腸道菌群與水體之間的相關性（Spearman correlation Rho0.15，P＜0.5）

10、；說明在牙鲆仔稚幼魚腸道菌群的形成過程中，餌料中的微生物對腸道菌群的影響大于水中微生物的影響，其對腸道菌群的影響起主要作用。
　　4.牙鲆仔稚幼魚腸道菌群結構變化規(guī)律。牙鲆開口后，腸道菌群發(fā)生明顯的演替，仔稚幼魚腸道優(yōu)勢菌群的種類和數(shù)量都發(fā)生了較大變化。攝食活餌料階段變形菌門主要定植在腸道內(nèi)，弧菌屬相對豐度最高；45日齡時期后變形菌門相對豐度逐漸減低，擬桿菌門和厚壁菌門豐度增加；在80日齡至115日齡時期，擬桿菌門的擬桿菌屬、普氏