膠質(zhì)瘤干-祖細胞的細胞與分子生物學特征研究.pdf

1、本研究分為四部分： 第一部分、膠質(zhì)瘤干/祖細胞長期培養(yǎng)及其特征分析 目的：以短期培養(yǎng)為主的人膠質(zhì)瘤干/祖細胞（human Glioma Stem Cells/Progenitors，hGSCPs）研究進展迅速，但各家報告的生物學特征不盡一致，建立一個生物學特征相對穩(wěn)定盼永生化細胞系勢在必行，可為深入探討膠質(zhì)瘤干/祖細胞生物學特征奠定基礎。 方法：將同一患者初發(fā)膠質(zhì)瘤和復發(fā)的播散灶內(nèi)的腫瘤組織制成單細胞，用CD13

2、3—免疫磁珠分選陽性細胞，在干細胞培養(yǎng)液中進行長期傳代培養(yǎng)和實時液氮凍存、復蘇后再培養(yǎng)。并根據(jù)無限增殖、多向分化等干細胞必備的指標進行鑒定。再用細胞擴增、分化走向、分子和細胞遺傳、致瘤性等指標觀察其生物學特征。 結(jié)果：從原發(fā)和復發(fā)的膠質(zhì)瘤組織中分離得到的CD133+細胞，分別在體外連續(xù)培養(yǎng)了58個月和64個月，液氮凍存后復蘇仍能保持無限增殖和多向分化的特征不變。在無血清干細胞培養(yǎng)基中呈球狀生長，能擴增、少分化；在含血清培養(yǎng)基中培

3、養(yǎng)能分化成多形性瘤細胞，貼壁生長無接觸抑制。免疫共聚焦結(jié)果顯示：腫瘤球體中CD133+細胞占少數(shù)，Nestin+細胞占多數(shù)；貼壁分化細胞中Nestin+細胞占絕對多數(shù)，即使有GFAP+和β—TubulinⅢ+細胞出現(xiàn)，但都共表達Nestin。球體細胞、貼壁細胞的DNA和染色體顯帶都為異倍體。腫瘤球裸小鼠原位移植瘤原發(fā)為局部侵襲性生長，而復發(fā)者為播散性生長，并廣泛浸潤軟腦膜。 結(jié)論：建立了來自同一患者兩株能在體外長期傳代培養(yǎng)，保持

4、無限增殖、多向分化潛能不變的人膠質(zhì)瘤干/祖細胞系，不僅有利于進一步研究膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲的特性和機制，還為研究其播散性復發(fā)等機制奠定了基礎。 第二部分、原發(fā)和復發(fā)膠質(zhì)瘤干/祖細胞在裸小鼠腦內(nèi)移植瘤的特征 目的：人源膠質(zhì)瘤干/祖細胞（human Glioma Stem Cells/ProgeIutors，hGSCPs）能分化成親本腫瘤細胞的全部亞型，在免疫缺陷動物腦內(nèi)具有高致瘤性已得到公認，但其侵襲性與親本腫瘤的關系以

5、及GSCPs與移植瘤組織中血管細胞的關系尚未明確。本研究探討源自同一患者原發(fā)和復發(fā)腫瘤組織的GSCPs在裸小鼠顱內(nèi)原位移植瘤的特征以及GSCPs移植瘤組織中的腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞的關系，旨在證明GSCPs裸小鼠原位移植瘤的侵襲性與親本腫瘤的關系和GSCPs在腦腫瘤組織重構中所起的作用。 方法：將已在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)的原發(fā)和復發(fā)hGSCPs球在立體定向儀輔助下接種到裸小鼠右腦尾狀核。實驗鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)時處死，取移植瘤組織常規(guī)石蠟包

6、埋、切片、HE、人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）和基質(zhì)金屬蛋白酶—1（matrix metalloproteinase—1，MMP1）染色，觀察其致瘤率、侵襲性和血管來源細胞。 結(jié)果：所接種的40只裸小鼠在30天內(nèi)全部因腫瘤而發(fā)病。無論是原發(fā)還是復發(fā)hGSCPS在裸小鼠腦內(nèi)接種部位里浸潤性生長的同時，還散布于其它區(qū)域。但兩者的侵襲形式不盡相同，原發(fā)者在接種側(cè)半球，呈團塊，局限于腦實質(zhì)；復發(fā)

7、者，還浸潤軟腦膜和對側(cè)半球，呈粟粒樣分布。MMP1+細胞的分布，復發(fā)者比原發(fā)者要密集得多。HLA染色顯示移植瘤中存在人源腫瘤細胞直接構成的血管。 結(jié)論：hGSCPs除了具有高致瘤性，還具有高侵襲性。復發(fā)的hGSCPs侵襲性更強，除了與MMP1高表達有關，還說明hGSCPs在侵襲性上具有親本腫瘤特異性。在hGSCPS的裸小鼠移植瘤中，腫瘤細胞在宿主腦內(nèi)廣泛分布并構成了血管。GSCPs可能轉(zhuǎn)分化成腫瘤血管細胞，在腦膠質(zhì)瘤組織重構中起

8、重要作用。 第三部分、克隆基因工程鼠的膠質(zhì)瘤干/祖細胞和神經(jīng)干/祖細胞 目的：據(jù)推測膠質(zhì)瘤干/祖細胞（Glioma Stem Cells/Progenitors，GSCPs）源于神經(jīng)干/祖細胞（Neural Stem Cells/ProgeIutors，NSCPs），但缺少實驗根據(jù)?？寺∫呀?jīng)發(fā)生膠質(zhì)瘤的基因工程鼠的GSCPs和NSCPs以及同品系胎鼠的NSCPs，旨在為進一步研究兩者淵源關系提供實驗用細胞。 方法

9、：取Tet—On小鼠位于小腦和大腦交界區(qū)域內(nèi)的腫瘤組織和位于遠離腫瘤的側(cè)腦室室管膜下及其周圍盼正常腦組織，分別制成單細胞懸液，分別培養(yǎng)于無血清干細胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基中。相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，電鏡觀察其超微結(jié)構，流式細胞儀檢測Hoechst33342陰性的SP細胞、細胞周期和染色體倍體，免疫熒光檢測球體及其分化細胞中的標志物表達情況。 結(jié)果：源于Tet—On鼠的腫瘤組織和室管膜區(qū)正常組織以及胎鼠腦組織細胞，在無血清培養(yǎng)基條件

10、下，呈懸浮的球體狀生長，并且表達Nstin；在含血清的培養(yǎng)條件下，貼壁分化成能表達膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元標志蛋白的細胞。細胞球體在體外已傳代。電鏡結(jié)果顯示，GSCPs球體細胞具有核質(zhì)比高、細胞器不發(fā)達的幼稚細胞特征。GSCPs球體中SP細胞比例為17.27%，NSCPs球體中SP細胞比例為2.48%，GSCPs球體中異倍體細胞比例為26，77%，NSCPs球體中異倍體細胞比例為0%。 結(jié)論：分別在Tet—On膠質(zhì)瘤模型鼠中克隆到的GS

11、CPs和室管膜區(qū)域的NSCPs，都能在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，為進一步研究兩者的細胞分子生物學關系奠定了基礎。 第四部分、膠質(zhì)瘤千/祖細胞的分子信息分析 目的：已知膠質(zhì)瘤干/祖細胞（Glioma Stem Cells/Progenitors，GSCPs）與神經(jīng)干/祖細胞（Neural Stem Cells/ProgeIutors，NSCPs）在分子信號傳遞通路開通和關閉時程調(diào)控上存在差異，而這種差異有可能就是NSCPs突變成G

12、SCPs的分子原因。通過基因表達譜分析，篩選其差異分子，為進一步研究膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子病因奠定基礎。 方法：取Tet—On膠質(zhì)瘤模型鼠的腫瘤組織中克隆到的GSCPs和室管膜區(qū)域的NSCPs以及來自于胎鼠胎腦的NSCPs，常規(guī)抽提和純化RNA，用Affymetrix Mouse Expression Array4302.0基因表達譜芯片檢測三種細胞的基因表達譜改變，進行兩兩對比篩選出上調(diào)2倍及以上的基因和下調(diào)2倍及以上的基因得到

13、三組數(shù)據(jù)。將初篩得到的三組差異表達基因分別進行cell—cycle、Wnt、Notch和TGF—βpathway的分析。 結(jié)果：通過對三種細胞的基因表達譜進行兩兩比較，經(jīng)初步篩選后上調(diào)2倍及以上的基因分別有3423條、1014條和2441條；下調(diào)2倍及以上的基因分別有2524條、2546條、4266條。cell—cycle、Wnt、Notch和TGF—βpathway分析結(jié)果顯示cell—cycle pathway在三組數(shù)據(jù)中都