LRIG2對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系GL15生物學(xué)特性的影響及其分子生物學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：富含亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白2--膠質(zhì)瘤細(xì)胞表皮生長因子受體信號(hào)網(wǎng)絡(luò)新的調(diào)控靶點(diǎn)
　　 目的：確定富含亮氨酸重復(fù)序列免疫球蛋白2(LRIG2)是膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL15中EGFR信號(hào)通路新的調(diào)控靶點(diǎn)。
　　 方法：培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL15細(xì)胞，經(jīng)表皮生長因子(EGF)100ng/ml,AG1478 10μM,放線菌酮 (CHX)10μg/ml體外干預(yù)后，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-P

2、CR）和Western Blot測(cè)定LRIG2 mRNA和蛋白表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)變化。
　　 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果顯示隨著EGF作用時(shí)間的延長，LRIG2 mRNA先上升后恢復(fù)至正常水平。Western blot結(jié)果顯示EGF作用后，表皮生長因子受體(EGFR)，磷酸化EGFR(pEGFR)均先上升后下降，LRIG2蛋白先下降，在30min時(shí)上升，120min下降至原水平的50%。CHX作用1.5h后，再加入EGF刺激，可見LRI

3、G2蛋白60min降至原水平的50%。而AG1478作用1h后，再用EGF刺激，EGFR未受明顯影響，pEGFR被明顯抑制，LRIG2蛋白水平變化不明顯。
　　 結(jié)論：EGFR活化后可導(dǎo)致LRIG2 mRNA表達(dá)上升，LRIG2蛋白合成增加。LRIG2為膠質(zhì)瘤細(xì)胞表皮生長因子受體信號(hào)網(wǎng)絡(luò)一個(gè)新的調(diào)控靶點(diǎn)。
　　 第二部分：LRIG2基因短發(fā)夾RNA表達(dá)穩(wěn)定株的建立及下調(diào)LRIG2對(duì)EGFR信號(hào)通路的影響
　　 目

4、的：構(gòu)建針對(duì)LRIG2基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)的表達(dá)載體，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,觀察目的基因表達(dá)的變化及其對(duì)EGFR信號(hào)通路的影響。
　　 方法：根據(jù)GenBank中LRIG2基因序列設(shè)計(jì)2條RNA干擾序列，命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2，同時(shí)設(shè)計(jì)1條非特異性序列作為陰性對(duì)照。據(jù)此設(shè)計(jì)合成各自的寡核苷酸鏈，退火后連接入pGenesil2載體，轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后進(jìn)行序列測(cè)定。用不同濃度的G418作用于GL1

5、5細(xì)胞，得到G418對(duì)于GL15細(xì)胞的篩選濃度。3種重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系GL15細(xì)胞，用G418篩選后挑單克隆后擴(kuò)增獲得穩(wěn)定株。逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR和Western印跡法分別在mRNA和蛋白水平上檢測(cè)LRIG2的表達(dá)。用表皮生長因子(EGF)100ng/ml體外干預(yù)得到的穩(wěn)定細(xì)胞株，Western Blot測(cè)定EGFR和磷酸化EGFR水平的變化。
　　 結(jié)果：3種重組表達(dá)載體(pGenesil2-LRIG2-shRNA1、

6、pGenesil2-LRIG2-shRNA2和pGenesil2-negative shRNA)經(jīng)限制性酶切及DNA測(cè)序分析證明序列插入正確。G418對(duì)于GL15細(xì)胞的篩選濃度為600μg/ml，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染三種質(zhì)粒的GL15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染 pGenesil2-LRIG2-shRNA2組細(xì)胞LRIG2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染pGenesil2-negative shRNA組，pGenesil2-LRIG2-shRNA1組LRIG2

7、蛋白無明顯變化。EGF刺激5分鐘和30分鐘后，pGenesil2-LRIG2-shRNA2組細(xì)胞EGFR和pEGFR蛋白水平均低于對(duì)照組。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對(duì)LRIG2基因的shRNA表達(dá)載體(pGenesil2-LRIG2-shRNA2)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可抑制LRIG2基因表達(dá)，LRIG2與LRIG1作用相反，下調(diào)LRIG2可減少EGF誘導(dǎo)的EGFR磷酸化，促進(jìn)EGFR降解。
　　 第三部分：RNA干擾LRIG2后

8、對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、凋亡、黏附和侵襲能力的影響
　　 目的：研究RNA干擾LRIG2基因表達(dá)后對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、細(xì)胞周期、凋亡、黏附和侵襲能力的影響。
　　 方法：MTT法檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)照組和siRNA組細(xì)胞的增殖，流式檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞黏附能力，Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)PCNA陽性細(xì)胞和LRIG2的細(xì)胞定位。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示siRNA組細(xì)

9、胞增殖率低于對(duì)照組。對(duì)照組PCNA陽性細(xì)胞率為72%，siRNA組為16%（p<0.01）。細(xì)胞周期分析表明對(duì)照組G0/G1期，S期和G2/M期分別為60.18%±5.00%，24.22%±5.37%和15.6%±1.54%，siRNA組為82.40%±2.47%，9.41%±1.87%和8.17%±1.01%（p<0.01），siRNA組自發(fā)性凋亡增加3倍。LRIG2 RNA干擾組黏附和侵襲能力高于對(duì)照組。LRIG2在GL15細(xì)胞中主