SATB1在膠質瘤中的表達與級別相關性和對生物學行為影響的研究.pdf

1、背景:
　　SATB1(special AT rich sequence binding protein)是一種組織特異性的核基質結合蛋白(matrix attachment regions binding protein)，在1992年被發(fā)現，目前認為其在胸腺和前體B細胞中顯著表達，腦組織中亦可見該基因的表達。SATB1可以與MAR區(qū)域結合并因此導致染色體結構的重塑，進而影響到下游基因的轉錄調控、表達，在細胞周期變化、細胞凋亡等

2、過程中起作用。
　　根據近期的研究表明，SATB1基因與多種腫瘤細胞的侵襲行為和轉移密切相關。通過對SATB1與乳腺癌的相關性的研究，首先發(fā)現該基因在乳腺癌的轉移方面起到明確的調控作用。高表達SATB1的乳腺腫瘤更加具有轉移和復發(fā)的傾向，因此也導致其預后情況更加不良。深入的研究表明SATB1高表達時，可以引起多個傳導通路中的近千個基因表達的改變，出現或上調或下調的明顯的變化?？紤]該基因有可能從結構的層面對整個染色體產生影響，因此，

3、已將該基因在腫瘤中的作用認為是一種“組織者”，而不是簡單的單個基因或傳導通路的變化。目前，已有越來越多的資料證實，該基因在胃癌、結腸癌、鼻咽癌、卵巢癌以及血液系統(tǒng)腫瘤的疾病中發(fā)揮重要的作用，與腫瘤的侵襲性、轉移、復發(fā)有密切的關系，繼而影響到腫瘤患者的預后。
　　腫瘤侵襲行為和腫瘤細胞增殖能力的增強可以由多種因素共同作用導致。目前的研究發(fā)現，這種腫瘤細胞生物學行為的變化，多數伴有基因水平的改變?；虻谋磉_調控是一個復雜的網絡系統(tǒng)，其

4、中涉及到的調控方式也是非常繁雜的。傳統(tǒng)的基因表達調控主要山轉錄水平的調節(jié)、轉錄后水平的調節(jié)和翻譯水平的調節(jié)組成。對于大多數基因來說，轉錄水平的調節(jié)是其主要調節(jié)方式，包括各種轉錄因子還有輔助因子的參與，RNA聚合酶轉錄體系的控制等等。轉錄后水平的調節(jié)包括RNA的加工，如加帽、加尾、剪接、堿基修飾等，還有mRNA運輸、胞漿內穩(wěn)定性的調節(jié)等。翻譯水平的調節(jié)主要在起始階段，如起始因子活性的調節(jié)、mRNA與小亞基結合的調節(jié)等。我們推測，SATB1

5、可能在侵襲相關基因的mRNA表達方面起到調節(jié)作用，從而影響下游基因的轉錄和翻譯，進一步影響到功能。除此之外，染色體結構方面的影響同樣可以導致下游相關基因的表達和激活，這種形式的調控涉及蛋白質構象等方面的改變，機制也更為復雜。目前的觀點是因為SATB1具有能和MAR區(qū)域結合的傾向，而MAR區(qū)域存在于很多基因的內含子區(qū)，SATB1通過和這些非轉錄區(qū)序列的結合可能導致其鄰近基因的轉錄活性發(fā)生改變，甚至有可能導致部分基因的啟動子產生變化，從而對

6、其下游基因的表達產生影響。
　　膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，同時也是最難治療的腫瘤之一，膠質瘤組織的浸潤性增長與復發(fā)常常使患者在出現癥狀后一二年內面臨腫瘤轉移而導致的死亡威脅。長期以來，不少研究者在尋求不同于手術等傳統(tǒng)途徑的治療方法來攻克這個難題，隨著基因治療開始作為一種新的治療方案開始應用于神經膠質瘤，該方向的研究也逐漸得到了重視。那么SATB1作為多種腫瘤發(fā)展過程中的基因調控組織者，是否在膠質瘤中發(fā)揮同樣的作用，我們以此為出

7、發(fā)點進行相關的研究。
　　材料和方法:
　　1、細胞培養(yǎng)
　　U87-MG和U251為人腦星形膠質母細胞瘤細胞系，均購自上海中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。U87-MG細胞用含有10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并使用含0.01MEDTA的0.25％胰酶按要求進行傳代和處理。
　　2、半定量RT-PCR

8、>　　將細胞RNA用Trizol一步法提取出來，并以500ngRNA為模板逆轉錄為cDNA，根據引物:內參β-actin:forward:5'-AAATCGTGCGTGACATTAA-3';reverse:5'-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3'; SATB1 sense5'-CAGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3'，SATB1 antisense5'-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3擴增。引物由Takara

9、 Biotechnology(Dalian，China)合成。PCR儀設定程序為94.0℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，共進行28個循環(huán)，產物經2％瓊脂糖電泳100V30分鐘，紫外線成像，結果使用Sigma-Gel software進行分析。
　　3、Western Blot實驗
　　按前述的方法進行細胞培養(yǎng)，提取細胞核蛋白，同時收集、提取總蛋白。Bradford法蛋白定量。10％SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜。5％脫

10、脂奶粉封閉30分鐘。以SATB1為一抗4℃孵育過夜，β-actin為內參，PBST沖洗3次，每次5分鐘。HRP標記的二抗室溫孵育2小時。PBST沖洗3次，每次5分鐘，ECL發(fā)光。
　　4、免疫熒光分析
　　用0.25％胰酶消化對數增長期的U87-MG細胞，制成細胞懸液，以6×103細胞/孔加入6孔細胞培養(yǎng)板（內放蓋玻片）。24小時后移去培養(yǎng)基，PBS洗1次，饑餓培養(yǎng)過夜，用4％多聚甲醛固定10分鐘。0.25％Trixton

11、X-100的PBS作用10分鐘，血清封閉1小時。加入SATB1抗體（1∶50稀釋），4℃孵育過夜，FITC標記兔抗羊抗體（1∶400稀釋），PBS洗3次，室溫孵育2小時。用熒光顯微鏡LeicaDMIRE2(Leica Microsystems Ltd,Germany)觀測，采集圖像。
　　5、免疫組化染色
　　用石蠟切片機將石蠟包埋的組織芯片的標本切割成厚度為6μm的切片，貼附與防脫載玻片上，65℃烘干30分鐘。將石蠟切片用

12、二甲苯脫蠟，水化，浸入EDTA中，高壓鍋抗原修復。3％H2O2滅活，兔血清封閉。SATB1抗體1∶50稀釋，4℃孵育過夜。陰性對照組用兔血清替代一抗4℃孵育過夜。HRP標記的二抗(KIT-5930，MaxVision，Fu Zhou，China)室溫孵育30分鐘。DAB顯色3分鐘。蘇木素復染，Permount(BIOS，Beijing，China)封片。顯微鏡(Olympus Optical，Japan)觀察，圖像采集。
　　免疫

13、組化染色強度結果判定:細胞核中出現棕色顆粒為SATB1陽性表達細胞。免疫組化染色強度結合瘤細胞陽性染色比例和染色強度進行判定。每例標本選擇2個有代表性的高倍視野，數200個腫瘤細胞，取平均值.陽性細胞數＜5％為陰性（-），5％-25％為弱陽性(+)，25％-50％為中度陽性(++)，＞50％為強陽性(+++)。
　　6、Realtime-PCR定量分析
　　將獲得的總RNA，使用SYBR PrimeScript RT-PCR

14、 Two-Step kit試劑盒按照說明書進行realtime RT-PCR檢測。PCR反應條件95℃10秒;95℃5秒，60℃20秒，40個循環(huán)。SATB1 Realtime PCR特異性引物: SATB1 sense5'-TGCAAAGGTTGCAGCAACCAAAAGC-3', SATB1 antisense5'-AACATGGATAATGTGGGGCGGCCT-3'。反應結束后分析Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線，

15、用Comparative Delta-delta Ct法進行相對定量分析。
　　7、組織芯片的制備及結果分析
　　腫瘤樣本來源于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院診斷為膠質瘤并接受治療的患者的術中樣本。診斷標準根據WHO標準。本研究基于赫爾辛基宣言標準，并被當地醫(yī)療機構的倫理委員會批準并同意使用來源于兩所醫(yī)院的組織樣本進行科學研究。實驗組標本來源于膠質瘤患者術中瘤組織，對照組非腫瘤樣本來源于癲癇患者行顳葉切除術的腦組織。組織在切除后快

16、速液氮冷凍，福爾馬林固定，石蠟包埋。根據文獻報道，用組織芯片機(Beecher Instruments，Silver Springs，MD，USA)制備組織芯片。組織芯片樣本包括25例散發(fā)星形細胞瘤（Ⅱ級），27例間變星形細胞瘤（Ⅲ級）和124例膠質母細胞瘤（Ⅳ級）。在每個膠質瘤典型病變區(qū)域提取兩個0.6rm孔徑的組織樣本，制作成由352個微點陣構成的組織芯片。另外，選取13例癲癇手術切除的非瘤腦組織制作成組織芯片，作為對照。染色方法同

17、免疫組化操作。
　　8、RNA干擾實驗
　　SATB1 siRNA為Santa(Santa Cruz，CO，USA)合成的SATB1 siRNA。根據操作手冊，用Santa transfection reagent轉染試劑將100nM SATB1 siRNA轉染入U87-MG細胞。control siRNA(Dharmacon)作為陰性對照。SATB1的沉默效率用Western Blot檢測。
　　9、SATB1過表達

18、脂質體的構建篩選和轉染實驗
　　選擇pEGFP-N1脂質體連入SATB1目的基因構建SATB1過表達質粒。根據序列特征，設計選用XhoⅠ和BamHⅠ對表達載體進行雙酶切，酶切產物電泳后回收約4.7kb的載體片段?；蛭膸煺{取目的基因后，連入脂質體。應用感受態(tài)細胞轉化，挑取并鑒定陽性克隆后，鑒定測序。脂質體構建完畢后，應用Lipofectamine對U87-MG細胞進行轉染，經G418篩選后，構建穩(wěn)定轉染細胞系。
　　10、M

19、TT分析。
　　通過MTT法來研究SATB1 siRNA干擾及過表達SATB1脂質體轉染對U87-MG細胞增殖的影響。將處理后的細胞胰酶消化制成懸液，計數3次，向96孔板每孔加細胞懸液200μl，約含5000個細胞，對照組只加相同體積的培養(yǎng)基。分別在0，24，48，72，96小時取出1個96孔板，每孔加20μl5mg/ml的MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時，將培養(yǎng)基吸出，每孔加150μlDMSO，震蕩10分鐘。570nm波長檢測吸光值

20、。
　　11、Transwell侵襲實驗
　　將50mg/L基質膠(BD bioscience，San Jose，CA，USA)與無血清培養(yǎng)基以1∶7比例混合，取50μl鋪于Transwell小室底部膜的上室面，待凝固后進行實驗。將轉染24小時后的U87-MG細胞胰酶消化制成懸液計數3次，向Transwell小室上室內加細胞懸液200μl（含1％FBS），約含2000個細胞。向下室加500μl培養(yǎng)基(含20％FBS)，再向上

21、室及下室同時添加EGF，對照組只加同體積的培養(yǎng)基。24小時后，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞。用甲醇和冰乙酸按1∶3的比例配制成固定液，將細胞固定30分鐘。風干后，用Giemsa工作液染色10分鐘，200倍視野下隨機選5個視野進行計數。
　　12、統(tǒng)計學分析
　　不同組間的比較用單因素方差分析，所有數據都用SigmaPlot軟件(SigmaSoftware Inc.，San Jose，CA)進行統(tǒng)計，P＜0.05具有統(tǒng)計學差

22、異。
　　結果:
　　1、SATB1在膠質瘤組織中基因和蛋白水平均有表達
　　在半定量的RT-PCR檢測中，我們可以看到SATB1可以被特異性的擴增，因此證實在核酸水平，SATB1基因穩(wěn)定的表達于這種腦組織最常見的惡性腫瘤中。在蛋白水平，我們充分論證了SATB1的表達與激活。使用western blot方法檢測，可以看到，在約115KD左右存在SATB1基因的穩(wěn)定表達的蛋白條帶，其強度與β-actin相比有一定差異。用

23、于檢測蛋白的36例不同級別的膠質瘤組織和培養(yǎng)的U87-MG、U251和T98G細胞系除有兩例為陰性外，其余均有SATB1的表達。為觀察SATB1在組織和細胞內的主要作用位置，我們分別進行了免疫熒光細胞化學和免疫組織化學檢測。在細胞的免疫熒光檢查中，可以發(fā)現有比較特意的核濃聚現象，說明該蛋白在核內表達與激活，但同時，在細胞漿中，亦可見有中等強度的熒光信號表達，可以推斷，該蛋白在胞漿中存在翻譯、組裝和修飾的過程。
　　2、SATB1在

24、膠質瘤組織中的表達程度與腫瘤級別相關
　　在定量realtime-PCR實驗中通過與內參基因的比對，我們發(fā)現，隨著腫瘤級別和惡性程度的增高，SATB1的表達量也在隨之發(fā)生增加。這也為我們進一步研究提供了新的思路。Western blot結果則提示蛋白水平，低級別膠質瘤與高級別相比，表達量有明顯差異，利用灰度計算軟件進行狄度值比較，可以得到兩組間有明顯的統(tǒng)計學差異(p＜0.01)。而在免疫組化試驗中，應用芯片技術通過對300余例不同

25、級別膠質瘤標本在同樣條件下的染色觀察，高級別腫瘤的陽性和強陽性表達率要明顯高于低級別腫瘤，兩組間有顯著差異(p＜0.01)。
　　3、SATB1 siRNA干擾后對膠質瘤細胞的增殖和侵襲無影響。
　　利用Santa公司合成的針對SATB1的SMART RNA Pool混合體，進行了RNA干擾試驗。結果發(fā)現，在有效的干擾SATB1后，經realtime PCR和western blot檢測，SATB1的表達量明顯下降，但根據M

26、TT利transwell實驗結果，我們發(fā)現經干擾后的U87-MG細胞在增殖和細胞侵襲方面卻并未發(fā)生變化。
　　4、SATB1過表達轉染后對膠質瘤細胞的增殖和侵襲性增強。
　　在基因水平干擾SATB1的表達并未對膠質瘤細胞的侵襲性和增殖能力產生影響，是否就可認為SATB1雖然在不同級別的腫瘤中存在表達差異，但并未調控與侵襲和增殖有關的行為呢？為更進一步說明這個問題，我們構建了過表達SATB1基因的脂質體進行這方面的研究。

27、>　　在成功構建表達SATB1基因的脂質體pEGFP-N1-SATB1后，經鑒定其序列完全與模板基因序列吻合，測序鑒定無誤后對U87-MG細胞進行穩(wěn)定轉染。我們使用lipofectamine2000作為轉染試劑，在600ng/ul濃度G418篩選6周后，獲得穩(wěn)定轉染的過表達SATB1基因的細胞系。同樣對SATB過表達的U87-MG細胞進行生物學行為方面檢測后，我們卻發(fā)現，MTT實驗的結果表明:過表達該基因的細胞在增殖能力上有一定的增強，