基于克隆異質(zhì)性篩選和鑒定人膠質(zhì)瘤干細(xì)胞及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、腫瘤具有明顯的異質(zhì)性。腫瘤實(shí)質(zhì)中，不同腫瘤細(xì)胞群體在增殖能力、分化程度、侵襲能力以及治療抵抗性等多方面存在差異。在體外培養(yǎng)條件下，腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力也存在異質(zhì)性，這種異質(zhì)性在體內(nèi)可能表現(xiàn)為不同腫瘤細(xì)胞在成瘤能力上的差異。根據(jù)成瘤能力的差異，可以將腫瘤細(xì)胞分為不同的亞群，那部分具有高度成瘤能力的腫瘤細(xì)胞被稱為腫瘤干細(xì)胞(tumorstemcells，TSCs)或癌癥干細(xì)胞(cancerstemcells，CSCs)，CSCs可分化形成

2、大量無(wú)腫瘤形成能力的腫瘤細(xì)胞，即非成瘤性腫瘤細(xì)胞(non-tumorigeniccancercells)。迄今為止，腫瘤干細(xì)胞在造血系統(tǒng)腫瘤以及多種實(shí)體瘤內(nèi)被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)，這部分細(xì)胞雖然為數(shù)極少，卻可以自我更新(復(fù)制)和無(wú)限增殖，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)和侵襲轉(zhuǎn)移的根源。 膠質(zhì)瘤是一類異質(zhì)性十分顯著的腫瘤。已經(jīng)有較多的證據(jù)表明膠質(zhì)瘤存在腫瘤干細(xì)胞即膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(Gliomastemcells，GSCs)。盡管膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的研究正在不

3、斷取得進(jìn)展，但膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分選仍是這一領(lǐng)域乃至腫瘤干細(xì)胞領(lǐng)域的一個(gè)基本而關(guān)鍵的問題。目前GSCs的分離或富集采用的方法多是利用流式細(xì)胞術(shù)或免疫磁珠技術(shù)對(duì)膠質(zhì)瘤內(nèi)的CD133+細(xì)胞進(jìn)行分選，因?yàn)镃D133+細(xì)胞經(jīng)證實(shí)具有腫瘤干細(xì)胞的特性。另一種常用的方法則是根據(jù)干細(xì)胞高表達(dá)ATP結(jié)合盒(ATP-bindingcassette)轉(zhuǎn)運(yùn)體的特點(diǎn)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)從膠質(zhì)瘤內(nèi)分離出“側(cè)亞群”(sidepopulation，SP)細(xì)胞，由于SP細(xì)胞經(jīng)

4、證實(shí)具有腫瘤干細(xì)胞的特性，因此篩選SP細(xì)胞也可以達(dá)到分選或富集腫瘤干細(xì)胞的目的。上述兩種方法不僅需要一定的設(shè)備，對(duì)細(xì)胞的活力也有影響，而且敏感性和特異性也存有疑問。因此，尋找新的GSCs分選策略或方法十分必要。 由于腫瘤干細(xì)胞與非成瘤性腫瘤細(xì)胞在分化程度、增殖能力上存在差異，所以體外培養(yǎng)時(shí)兩者的克隆形成能力可能也會(huì)不同，并可能形成不同表型的克隆。有研究報(bào)道，頭頸部鱗癌、乳腺癌以及前列腺癌細(xì)胞形成的克隆具有形態(tài)異質(zhì)性，其中的一類形

5、態(tài)規(guī)則緊密的克隆含有腫瘤干細(xì)胞，其成瘤能力很強(qiáng)，少至100個(gè)細(xì)胞即可在動(dòng)物體內(nèi)形成移植瘤，而其他類型的克隆無(wú)成瘤能力。因此，細(xì)胞克隆的異質(zhì)性尤其是形態(tài)上的異質(zhì)性可能有助于對(duì)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行分選或富集。這種方法操作較簡(jiǎn)單，而且比較符合腫瘤干細(xì)胞的功能定義，為獲得腫瘤干細(xì)胞提供了新的思路。但在膠質(zhì)瘤是否存在克隆異質(zhì)性，以及這種異質(zhì)性是否可用于對(duì)GSCs的識(shí)別和分選，目前還未見文獻(xiàn)報(bào)道，而且利用克隆形態(tài)的異質(zhì)性對(duì)含有腫瘤干細(xì)胞克隆進(jìn)行識(shí)別和分選

6、的機(jī)制還從未被闡明。 為解決上述問題，本研究以人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251為模型，觀測(cè)其克隆異質(zhì)性并進(jìn)行分類，初步篩選鑒定出GSCs克隆，并部分闡明了利用克隆形態(tài)異質(zhì)性識(shí)別腫瘤干細(xì)胞克隆的機(jī)制。另外，我們還觀測(cè)了人間變性星形少突膠質(zhì)瘤的GSCs在動(dòng)物體內(nèi)的成瘤能力和分化特性，鑒定了其腫瘤干細(xì)胞特性。本研究共分為三個(gè)部分： 第一部分，觀測(cè)了U251細(xì)胞克隆形態(tài)及分化的異質(zhì)性。本部分進(jìn)行了U251細(xì)胞的克隆形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其克隆

7、形成率為7.88％。根據(jù)克隆形態(tài)將其分為緊密型，中間型和松散型三類。三種類型的克隆所占比例分別為11.9％，61.0％和27.1％。利用免疫細(xì)胞染色、激光共聚焦術(shù)觀察克隆三種分化標(biāo)記物GFAP，vimentin及nestin表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)緊密型克隆GFAP表達(dá)最弱，vimentin，nestin的表達(dá)最強(qiáng)；松散型克隆GFAP表達(dá)最強(qiáng)，而vimentin，nestin表達(dá)最弱；中間型克隆上述三種標(biāo)記物均有一定程度表達(dá)，居于緊密型和松散

8、型之間。 第二部分，分離和鑒定了U251細(xì)胞系內(nèi)GSCs克隆，探討不同克隆形態(tài)發(fā)生機(jī)制。本研究利用克隆柱對(duì)分化程度最低的緊密型克隆進(jìn)行分離，將細(xì)胞低密度接種再次進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示來(lái)自緊密型克隆的細(xì)胞能再次形成緊密型克隆，具有自我更新能力，而且緊密型克隆的細(xì)胞除能復(fù)制自身的克隆類型以外，還可產(chǎn)生中間型和松散型克??；將緊密型克隆細(xì)胞接種至干細(xì)胞培養(yǎng)基，可見其與神經(jīng)干細(xì)胞類似，能形成懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球，免疫細(xì)胞染色顯示細(xì)胞球表達(dá)

9、CD133；將緊密型克隆形成的細(xì)胞球接種至含血清的培養(yǎng)基2周后，細(xì)胞球貼壁并發(fā)生分化，產(chǎn)生的細(xì)胞能分別表達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)三種細(xì)胞譜系的標(biāo)志物GFAP、MBP和β-tubulinⅢ，而且部分細(xì)胞可同時(shí)表達(dá)GFAP和β-tubulinⅢ。本部分研究還通過(guò)損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)比較了不同克隆內(nèi)細(xì)胞的遷移能力，并利用免疫化學(xué)染色顯示與遷移相關(guān)的細(xì)胞骨架微絲F-actin在細(xì)胞內(nèi)的分布和排列方式。結(jié)果顯示，來(lái)自緊密型克隆的細(xì)胞體外遷移能力低下，細(xì)胞

10、骨架發(fā)育幼稚，F(xiàn)-actin排列紊亂，極性不明顯，而來(lái)自松散型克隆的細(xì)胞在體外具有更強(qiáng)的遷移能力。另外，緊密型克隆CD44呈強(qiáng)陽(yáng)性，其表達(dá)高于中間型和松散型克隆，提示CD44可能是緊密型克隆細(xì)胞侵襲能力較強(qiáng)的分子基礎(chǔ)之一。 第三部分，觀察了人原發(fā)性間變性少突.星形細(xì)胞瘤GSCs在動(dòng)物體內(nèi)的成瘤能力。本部分利用從原代培養(yǎng)的人間變性少突-星形細(xì)胞瘤細(xì)胞中分離獲得的GSCs進(jìn)行異種移植，證明這些GSCs在體內(nèi)成瘤后發(fā)生異質(zhì)性分化，再現(xiàn)

11、了混合性膠質(zhì)瘤的生物學(xué)特性，并富含未分化細(xì)胞。 以上三部分研究提示： 1.U251細(xì)胞形成的克隆在形態(tài)和分化程度上具有異質(zhì)性，存在緊密型、中間型、松散型三類克隆，其中緊密型克隆的分化程度最低。 2.來(lái)自緊密型克隆的細(xì)胞具有自我更新、多向分化能力等腫瘤干細(xì)胞的特性；其體外遷移能力低下可能是此型克隆形態(tài)發(fā)生的重要機(jī)制之一。 3.GSCs經(jīng)異種移植成瘤后形成異質(zhì)性分化的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，并富含未分化細(xì)胞。 綜