分離鑒定人小涎腺間充質(zhì)干細(xì)胞.pdf

1、目的:探索人的小涎腺中成纖維樣細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)方法,并通過分析其體外增殖和多向分化能力,結(jié)合免疫表型檢測,鑒定其干細(xì)胞性質(zhì)。并進(jìn)一步探索小涎腺中成纖維樣單克隆細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增方法,并鑒定其性質(zhì)。
　　 方法:組織塊貼壁培養(yǎng)法原代分離、培養(yǎng)人小涎腺成纖維樣細(xì)胞；觀察原代及傳代后不同代數(shù)細(xì)胞形態(tài)的變化；通過繪制MTT細(xì)胞生長曲線、計(jì)算克隆形成率和觀察不同代數(shù)細(xì)胞擴(kuò)增速度來分析細(xì)胞的增殖能力；直接免疫熒光法流式細(xì)胞學(xué)檢測第三代

2、細(xì)胞的免疫表型；將細(xì)胞向中胚層起源的成骨、脂肪和軟骨細(xì)胞,內(nèi)胚層起源的肝細(xì)胞和外胚層起源的神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化,鑒定其多項(xiàng)分化潛能；96孔板稀釋鋪板法進(jìn)行成纖維樣單克隆細(xì)胞的培養(yǎng),并進(jìn)行成骨,成脂肪和成軟骨誘導(dǎo)分化。
　　 結(jié)果:成功的在體外分離培養(yǎng)出人小涎腺成纖維樣細(xì)胞,傳至第四代細(xì)胞形態(tài)保持良好。細(xì)胞體外增殖能力旺盛。流式檢測結(jié)果證實(shí)細(xì)胞表達(dá)普遍認(rèn)可的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD13、CD29、CD44、CD90、CD73、CD105

3、、CD166,不表達(dá)造血干/祖細(xì)胞標(biāo)記CD117、CD34、CD45。成脂肪誘導(dǎo)一周左右均有脂滴形成,oil red0染色陽性,并逐漸增多。成骨誘導(dǎo)8天后,堿性磷酸酶表達(dá)陽性率100％,19天后骨鈣素大量表達(dá),并形成鈣結(jié)節(jié)。成軟骨誘導(dǎo)第8天有極少量細(xì)胞Alcian Blue染色陽性,誘導(dǎo)19天后Alcian Blue染色和CollagenⅡ免疫細(xì)胞化學(xué)染色均為陽性。誘導(dǎo)第24天,RT—PCR檢測各分化方向的特異性基因:脂肪細(xì)胞aP2、C

4、/EBPa、PPARy,成骨細(xì)胞osteopontin,軟骨細(xì)胞collagenⅡ、aggrecan基因均為陽性表達(dá)。向肝細(xì)胞誘導(dǎo)14天,形成肝樣細(xì)胞,并表達(dá)AFP、ALB和CK18。向神經(jīng)元誘導(dǎo)5h后,細(xì)胞表現(xiàn)為神經(jīng)元樣形態(tài),nestin陽性細(xì)胞增多。成纖維樣單克隆細(xì)胞有較強(qiáng)的多項(xiàng)分化能力。
　　 結(jié)論:所建立的體外分離培養(yǎng)體系能夠獲得大量人小涎腺成纖維樣細(xì)胞,體外增殖能力強(qiáng),免疫表型類似于間充質(zhì)干細(xì)胞,在誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下能分化