抗菌型間充質(zhì)干細(xì)胞的構(gòu)建與功能鑒定.pdf

1、膿毒癥(sepsis)是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，病情惡化快，死亡率高，是嚴(yán)重?zé)?、?chuàng)傷患者、腫瘤等危重病患者晚期死亡的主要原因。目前尚無針對(duì)膿毒癥的特效治療方法，當(dāng)前的治療方案仍是抗感染和涉及幾乎所有系統(tǒng)的全身支持治療，研究進(jìn)展也遲遲沒有突破。
　　值得欣慰的是，近年來研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞不僅具有再生修復(fù)功能，還具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎的特性。干細(xì)胞移植對(duì)于脊髓損傷、心肌缺血性損傷、急性肺損傷、急性腦損傷和骨股頭壞死等組織損傷性疾病的治

2、療顯示了出好的療效。此外，干細(xì)胞移植治療膿毒癥方面也顯示出驚人在療效。干細(xì)胞一方面可通過旁分泌作用，分泌一些如TGF-β、IL-10、IL-13和TSG-6等抗炎細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥反應(yīng);另一方面，干細(xì)胞還可直接與樹突狀細(xì)胞、NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞相互作用，直接調(diào)控這些免疫細(xì)胞的功能，在抗炎和免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示干細(xì)胞移植治療膿毒癥有明顯的療效，大大降低的死亡率，并有效控制機(jī)體的過度炎癥反應(yīng)。

3、
　　殺菌/通透性增加蛋白（Bactericidal/permeability-increasing protein，BPI）是一種從中性粒細(xì)胞初級(jí)顆粒中釋放的55kDa大小的抗菌肽，具有革蘭陰性細(xì)胞毒作用和LPS中和能力，是先天免疫系統(tǒng)的組成部分。rBPI21是由野生型BPI蛋白N'端的21 kDa的片段組成的重組蛋白，其較野生型蛋白具有更強(qiáng)、更穩(wěn)定的生物學(xué)功能。在基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中rBPI21被證實(shí)對(duì)肺炎、膿毒癥等感染性疾病

4、都有保護(hù)效應(yīng)，更重要的是其在臨床試驗(yàn)中也顯示了治療效果。
　　LL-37是Cathelicidin抗菌蛋白家族在人類身上的唯一成員，它可以被多種組織和細(xì)胞分泌，具有殺滅和抑制多種病原微生物生長的活性，不易耐藥，對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病毒都有作用，對(duì)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病毒都有作用。近年來的研究還發(fā)現(xiàn)了LL-37具有免疫調(diào)節(jié)和促愈的作用。
　　本研究著眼于膿毒癥的疾病特點(diǎn)和研究現(xiàn)狀，提出“抗菌、抗內(nèi)毒素、抗

5、炎和組織器官保護(hù)綜合治療”的治療策略，并尋求和驗(yàn)證可應(yīng)用于該策略的治療藥物。
　　目的:
　　1.將rBPI21和與之類似的陽離子抗菌肽LL-37融合，以期獲得抗菌能力增強(qiáng)且具備免疫調(diào)節(jié)能力的抗菌融合蛋白。
　　2.應(yīng)用構(gòu)建完成的BPI-LL37抗菌融合蛋白對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，提高間充質(zhì)干細(xì)胞的抗菌和毒素中和能力，以期獲得具有殺菌、中和內(nèi)毒素的抗菌型間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　方法:
　　通過PCR方法從B

6、PI和LL-37基因的cDNA中擴(kuò)增并突變獲得需要的rBPI21和LL37活性片斷，構(gòu)建rBPI21-LL37/LL37-rBPI21融合蛋白的表達(dá)載體，BPI蛋白質(zhì)和LL-37蛋白質(zhì)之間通過柔性片段(GGSGG)連接。之后將表達(dá)載體用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入模式細(xì)胞A549中。后通過Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的情況，通過抑菌試驗(yàn)驗(yàn)證此融合蛋白的分泌與抗菌能力。
　　融合蛋白構(gòu)建成功后，將表達(dá)載體上的融合蛋白基因

7、克隆至慢病毒載體中，并將其包裝成為具有生物活性的慢病毒顆粒。再用慢病毒感染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，以完成對(duì)其的基因修飾。之后通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定感染后的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志，通過Western blot鑒定感染后的MSCs中融合蛋白的表達(dá)情況，通過抑菌試驗(yàn)鑒定含有感染后的MSCs外分泌物質(zhì)的培養(yǎng)上清是否具有抗菌能力。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、DNA電泳和DNA測(cè)序證實(shí)融合蛋白表達(dá)載體（pLVX-BPI-LL-

8、37）構(gòu)建成功;Western blot檢測(cè)結(jié)果表明融合蛋白rBPI21-LL37/LL37-rB PI21能被真核細(xì)胞A549細(xì)胞表達(dá)，融合蛋白大小介于25～30 kDa;抑菌試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證此融合蛋白具有抑制細(xì)菌生長的生物學(xué)效應(yīng)。
　　2.成功的分離并培養(yǎng)了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)其的表面標(biāo)志鑒定和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)都符合相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。
　　3.成功的包裝了融合蛋白慢病毒顆粒，應(yīng)用慢病毒感染完成了對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的基因修飾。流式細(xì)胞術(shù)顯