惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移方向指示及趨化引導(dǎo)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤，約占所有成人顱內(nèi)腫瘤的40％～50％[1]，其中多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM）惡性程度最高，預(yù)后極差[2]。如果僅進(jìn)行支持治療，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的中位生存期不足3個(gè)月，97％的病人在12個(gè)月內(nèi)死亡;采用手術(shù)切除并輔以放射治療和化學(xué)治療的方案后，病人的中位生存期仍不足12個(gè)月[3]。近十余年來(lái)，盡管隨著外科手術(shù)技術(shù)的提高以及新的放化療方案的應(yīng)用，膠質(zhì)母細(xì)胞

2、瘤患者的總體生存期有所延長(zhǎng)，但是絕大多數(shù)患者仍然避免不了腫瘤復(fù)發(fā)和最終走向死亡的噩運(yùn)。
　　 惡性膠質(zhì)瘤侵襲遷移的生物學(xué)特性嚴(yán)重制約了療效的進(jìn)一步提高，同時(shí)也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和不良預(yù)后的主要原因。因此，對(duì)惡性膠質(zhì)瘤侵襲遷移特點(diǎn)及機(jī)制的研究將對(duì)改善其臨床治療具有重要意義。然而，目前我們?cè)谘芯磕[瘤細(xì)胞遷移時(shí)仍缺乏能夠在組織切片中指示細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向的指標(biāo)。高爾基體(golgi)作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成后的加工修飾場(chǎng)所廣泛存在于真核細(xì)胞中。有研

3、究證明，高爾基體參與細(xì)胞微管形成中心的構(gòu)成，并且在細(xì)胞極性的建立、維持和細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4,5]。
　　 惡性膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)侵襲遷移的途徑與大腦的解剖結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞可以沿著腦白質(zhì)纖維束、血管外膜、軟膜以及室管膜浸潤(rùn)播散，其中主要是沿著有髓白質(zhì)纖維[6,7]。此外，趨化因子在細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Zagzag等[8]發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞定向遷移相關(guān)的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromalcell

4、-derivedfactor-1α，SDF-1α)和其特異性受體CXCR4在血管周圍以及白質(zhì)纖維束和軟膜下表達(dá)。因此，我們推測(cè)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能是在SDF1/CXCR4軸的引導(dǎo)下，沿著血管基底膜或沿白質(zhì)纖維束以血管niche為中繼站向周圍方向浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。
　　 本課題研究分為以下二個(gè)部分:
　　 第一部分通過(guò)免疫熒光染色的方法觀察體外劃痕實(shí)驗(yàn)中C6細(xì)胞、U251細(xì)胞和SNB19細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)遷移過(guò)程中高爾基體在細(xì)胞中的定位與

5、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向的關(guān)系;鬼筆環(huán)肽細(xì)胞骨架染色，觀察高爾基體與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)偽足的位置關(guān)系;免疫組化染色觀察人腦和大鼠腦膠質(zhì)瘤組織切片中細(xì)胞高爾基體在細(xì)胞中的定位與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向的關(guān)系，進(jìn)而探究高爾基體作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向指示的可行性及其在研究細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)方面的生物學(xué)意義。結(jié)果顯示:體外劃痕實(shí)驗(yàn)中位于劃痕兩側(cè)的絕大多數(shù)C6細(xì)胞(83％±6％)、U251細(xì)胞(80％±7％)、SNB19細(xì)胞(82％±6％)的高爾基體朝向劃痕空白側(cè);鬼筆環(huán)肽細(xì)胞骨架染色顯示U

6、251細(xì)胞和SNB19細(xì)胞中高爾基體的定位方向與細(xì)胞的偽足伸展方向一致;免疫組化染色顯示，腫瘤組織標(biāo)本中壞死區(qū)周圍腫瘤細(xì)胞的高爾基體多數(shù)（鼠腦80％±7％;人腦82％±6％）背向壞死側(cè)。
　　 第二部分通過(guò)免疫熒光染色、Westernblot檢測(cè)CXCR4和SDF-1α在C6細(xì)胞、U251細(xì)胞、U87細(xì)胞和HUVEC中的表達(dá);免疫組化染色檢測(cè)CXCR4和SDF-1α在腫瘤標(biāo)本中的表達(dá);利用Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)探究SDF

7、-1/CXCR4在腫瘤細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的作用，根據(jù)下室所加趨化劑差異實(shí)驗(yàn)分為5組，對(duì)照組:加入600μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基;SDF-1α誘導(dǎo)組:加入600μ.l含SDF-1α(100nmol/ml)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基;HUVEC上清誘導(dǎo)組:加入600μl提前制備好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清;H+AMD3100處理組:加入600μl含AMD3100（25μg/ml）的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清;S+AMD3100處理組:加入60

8、0μl含SDF-1α(100nmol/ml)和AMD3100（25μg/ml）的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。運(yùn)用立體定向注射技術(shù)建立C6細(xì)胞Wistar大鼠腦胼胝體原位移植模型，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、鏡像切片H&E和白質(zhì)纖維束染色研究腫瘤細(xì)胞在腦白質(zhì)中的遷移特點(diǎn)以及分布規(guī)律。結(jié)果顯示:C6細(xì)胞、U251細(xì)胞和U87細(xì)胞中表達(dá)CXCR4，HUVEC中表達(dá)SDF-1α;腫瘤標(biāo)本免疫組化染色顯示腫瘤細(xì)胞表達(dá)CXCR4，血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SDF-1α;

9、transwell實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組(C6:2.9±1.8;U251:3.1±1.8;U87:2.3±1.8)和SDF-1α+AMD3100組(C6:2.8±1.5;U251:2.1±1.0;U87:1.7±1.2)中有極少量的細(xì)胞能夠穿過(guò)小室膜，并且穿過(guò)小室膜的細(xì)胞形態(tài)不佳(P＞0.05);SDF-1α(C6:107.5±15.6;U251:110.7±13.1;U87:109.5±13.5)和HUVEC上清液(C6:99.6±13.2;U

10、251:104.7±13.1;U87:106.9±12.7)都對(duì)細(xì)胞有很強(qiáng)的趨化作用，兩組之間對(duì)比沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);H+AMD3100處理組(C6:20.1±4.5;U251:15.6±3.8;U87:15.1±4.3)細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)明顯受到影響，與HUVEC上清組對(duì)比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);S+AMD3100處理組細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)明顯受到影響，與SDF-1α組對(duì)比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);鏡像切片

11、H&E和白質(zhì)纖維束染色顯示腫瘤細(xì)胞在腦內(nèi)沿白質(zhì)纖維束的走行方向在纖維束間遷移運(yùn)動(dòng)并在微血管旁聚集;免疫組化Ki-67染色顯示聚集在微血管旁的腫瘤細(xì)胞具有較高的增殖活性。
　　 結(jié)論:
　　 1.腫瘤細(xì)胞高爾基體的定位方向?qū)τ谂袛囿w內(nèi)、外細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)方向具有參考意義。
　　 2.惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞能夠在腦內(nèi)沿著白質(zhì)纖維束的走行方向在纖維束間遷移運(yùn)動(dòng)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞遷移路徑中出現(xiàn)微血管時(shí)，部分腫瘤細(xì)胞會(huì)趨向于微血管旁nic