缺氧對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞“干性”的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、星形細(xì)胞腫瘤是顱內(nèi)最為常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤之一，占所有顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤的60％以上。盡管采取了包括外科手術(shù)及放化療在內(nèi)的綜合性治療措施，星形細(xì)胞瘤的預(yù)后仍然很差，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的平均生存時(shí)間仍不足一年。越來(lái)越多的證據(jù)表明，癌癥是一種干細(xì)胞疾病。癌癥干細(xì)胞，或稱(chēng)為干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞，是腫瘤組織中的一小群具有無(wú)限自我更新能力、多向分化潛能的特殊細(xì)胞群體。癌癥干細(xì)胞具有重要的生物學(xué)及治療學(xué)意義，它們被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、演進(jìn)及復(fù)發(fā)的細(xì)胞源泉。惡性膠質(zhì)瘤是最

2、早被證實(shí)存在癌癥干細(xì)胞的實(shí)體腫瘤之一，我們課題組前期亦從腦膠質(zhì)瘤新鮮組織及已建立的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，如U87及U251細(xì)胞中分離得到膠質(zhì)瘤干細(xì)胞并在體外成功培養(yǎng)和鑒定。癌癥干細(xì)胞，如同其相對(duì)應(yīng)的成體干細(xì)胞一樣，也需要某種特定的微環(huán)境，即niche，以維持其自我更新能力，保持未分化狀態(tài)。
　　缺氧是包括惡性膠質(zhì)瘤在內(nèi)的實(shí)體腫瘤的基本特征之一。缺氧通過(guò)激活多種信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞存活、增加瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力、促進(jìn)腫瘤新生血管化，從而在腫瘤惡性進(jìn)

3、展中發(fā)揮重要作用。新近有證據(jù)表明，缺氧可能是構(gòu)成膠質(zhì)瘤干細(xì)胞微環(huán)境的關(guān)鍵組分之一。缺氧在體外可維持腫瘤干細(xì)胞自我更新能力，保持其處于未分化狀態(tài)，但到目前關(guān)于缺氧與腫瘤干細(xì)胞關(guān)系的研究均系體外研究，尚缺乏來(lái)自臨床腫瘤樣本的直接證據(jù)；此外，缺氧調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞“干性”的分子機(jī)制尚缺乏研究。
　　研究目的:
　　1.探討缺氧標(biāo)記物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)規(guī)律及表達(dá)模式，重點(diǎn)觀測(cè)CA IX表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)之間的關(guān)系；<

4、br>　　2.探討惡性膠質(zhì)瘤組織中CA IX表達(dá)的臨床病理學(xué)意義，評(píng)價(jià)其作為預(yù)后指標(biāo)的應(yīng)用價(jià)值；
　　3.探討缺氧對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞功能的影響，重點(diǎn)觀測(cè)缺氧對(duì)細(xì)胞形態(tài)、克隆形成、干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)及分化的作用，以證明缺氧可誘導(dǎo)已分化瘤細(xì)胞去分化，獲得干細(xì)胞特性；
　　4.探討缺氧對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新、分化及干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響，以證明缺氧可維持或增強(qiáng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”；
　　5.初步探討Notch信號(hào)在缺氧誘導(dǎo)的GS

5、Cs“干性”維持或增強(qiáng)中的作用。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　1.缺氧標(biāo)記物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)研究：以人惡性膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本為研究材料，采用免疫激光捕獲顯微切割(i-LCM)、免疫組化及雙標(biāo)免疫熒光、激光共聚焦顯微術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)，觀測(cè)CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)模式，評(píng)價(jià)其臨床病理學(xué)意義及與患者預(yù)后的關(guān)系，并著重探討CA IX表達(dá)與GSCs標(biāo)志物表達(dá)之間的關(guān)系。
　　2.缺氧對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞“干性”

6、調(diào)節(jié)的體外研究：以U87、U251細(xì)胞系及3例原代培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究材料，建立缺氧培養(yǎng)模型，采用透射電鏡觀測(cè)瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；MTT法檢測(cè)缺氧對(duì)生長(zhǎng)的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期；Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)瘤細(xì)胞克隆形成能力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD133表達(dá)；分別采用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物及分化標(biāo)志物mRNA和蛋白表達(dá)。
　　3.缺氧調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”的體

7、外研究：運(yùn)用條件培養(yǎng)基壓力篩選的方法從上述膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分離培養(yǎng)干細(xì)胞樣克隆球，并進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)志物鑒定；采用干細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和分化實(shí)驗(yàn)分別觀測(cè)缺氧對(duì)GSCs自我更新及分化的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD133表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)干細(xì)胞及分化標(biāo)志物表達(dá)；Western blot檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白表達(dá)；
　　4. Notch信號(hào)通路在缺氧誘導(dǎo)的GSCs“干性”調(diào)節(jié)中作用的初步研究：采用Western blot檢測(cè)缺氧對(duì)GSCs Notch信

8、號(hào)關(guān)鍵分子表達(dá)的影響；以Notch信號(hào)特異性抑制劑DAPT處理細(xì)胞，檢測(cè)其對(duì)Notch1的抑制作用，確定合適的濃度(5μg/ml)；采用干細(xì)胞克隆形成及分化實(shí)驗(yàn)觀測(cè)DAPT對(duì)缺氧誘導(dǎo)的GSCs“干性”增強(qiáng)及分化抑制的拮抗作用。
　　研究結(jié)果:
　　1.缺氧標(biāo)記物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義：CA IX在惡性膠質(zhì)瘤中呈過(guò)度表達(dá)，多表達(dá)于高級(jí)別膠質(zhì)瘤壞死灶周邊及低級(jí)別膠質(zhì)瘤侵襲性邊沿的瘤細(xì)胞。CA IX表達(dá)與

9、腫瘤組織學(xué)分級(jí)及大小關(guān)系密切；CA IX(++)組患者的總體生存期及無(wú)疾病進(jìn)展生存期均顯著低于CA IX(+)及CA IX(-)組患者(p＜0.001)；多因素分析顯示CA IX(++)(p＜0.001)為預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。
　　2.缺氧標(biāo)記物CA IX表達(dá)與干細(xì)胞、侵襲標(biāo)志物表達(dá)之間的關(guān)系：雙標(biāo)免疫熒光檢測(cè)顯示CA IX陽(yáng)性區(qū)域表達(dá)CD133、Oct4、Sox2及CXCR4的瘤細(xì)胞數(shù)目均分別顯著高于臨近的CA IX陰性區(qū)域，

10、而CA IX的表達(dá)與p53及Ki-67無(wú)關(guān)；顯微切割獲得的CA IX陽(yáng)性瘤細(xì)胞CA IX、Oct4、Sox2及CXCR4 mRNA水平明顯高于相對(duì)應(yīng)的臨近CA IX陰性瘤細(xì)胞。
　　3.缺氧對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞“干性”調(diào)節(jié)的體外研究：缺氧培養(yǎng)條件下，膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化，總體上是從成熟變得“幼稚”，表現(xiàn)為細(xì)胞器減少、膠質(zhì)纖維絲消失、細(xì)胞核仁的出現(xiàn)等；缺氧顯著增強(qiáng)瘤細(xì)胞克隆形成能力，增加緊密型克隆形成的比例；缺氧增強(qiáng)瘤細(xì)胞的遷

11、移能力；流式細(xì)胞檢測(cè)顯示缺氧顯著提高CD133陽(yáng)性細(xì)胞比例；缺氧條件下干細(xì)胞標(biāo)志物mRNA及蛋白水平明顯上調(diào)，而GFAP表達(dá)明顯減弱；總體上缺氧對(duì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期及凋亡的影響并不明顯。
　　4.缺氧調(diào)控膠質(zhì)瘤干細(xì)胞“干性”的體外研究：采用條件培養(yǎng)基壓力篩選成功獲得膠質(zhì)瘤干細(xì)胞克隆球，后者高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物；缺氧培養(yǎng)下，GSCs克隆球形成比例及大小均明顯增加，而克隆球向膠質(zhì)細(xì)胞的分化明顯受抑；缺氧培養(yǎng)使得GSCs CD133陽(yáng)性

12、細(xì)胞比例明顯增高，干細(xì)胞標(biāo)記物Oct-4及Sox-2蛋白表達(dá)上調(diào)。
　　5. Notch信號(hào)通路在缺氧誘導(dǎo)的GSCs“干性”調(diào)節(jié)中的作用：缺氧處理后GSCs Notch信號(hào)關(guān)鍵分子(Notch1，Notch1 ICD，Hes-1)蛋白表達(dá)明顯上調(diào)；以DAPT處理后，GSCs Notch1蛋白水平顯著下降，呈現(xiàn)梯度依賴(lài)性，5ug/ml DAPT對(duì)Notch1蛋白表達(dá)的抑制率達(dá)80％；以5ug/ml DAPT處理各組GSCs，可顯著抑

13、制缺氧對(duì)GSCs克隆形成增強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，降低克隆形成數(shù)目，形成的克隆體積也明顯縮小。同時(shí)可部分抵消缺氧誘導(dǎo)的GSCs分化抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1.缺氧標(biāo)志物CA IX在惡性膠質(zhì)瘤過(guò)度表達(dá)，其高表達(dá)意味著較高的組織學(xué)分級(jí)及預(yù)后不良，CA IX介導(dǎo)的腫瘤惡性進(jìn)展可能與瘤細(xì)胞“干性”增強(qiáng)及侵襲力的增加有關(guān)；
　　2.我們首次證實(shí)了在惡性膠質(zhì)瘤組織中CA IX陽(yáng)性區(qū)域存在更多干細(xì)胞樣表型的瘤細(xì)胞，而且切割的CA IX(+