腫瘤微環(huán)境中星形細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)論述：
　　第一部分 星形細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤耐藥性的影響及機(jī)制研究
　　背景：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見(jiàn)且最致命的原發(fā)性腫瘤，因其浸潤(rùn)生長(zhǎng)的特點(diǎn)，手術(shù)完全切除十分困難。雖然手術(shù)聯(lián)合放療和化療能增加GBM患者生存期，但其預(yù)后仍差，復(fù)發(fā)率高，中位生存期僅為14.6個(gè)月。相關(guān)研究顯示，膠質(zhì)瘤對(duì)化療藥物的耐受性是患者術(shù)后復(fù)發(fā)、生存期縮短的重要原因之一。替莫唑胺(temo

2、zolomide，TMZ)和長(zhǎng)春新堿(vincristine，VCR)是臨床上常用的、用于治療膠質(zhì)瘤的兩種不同機(jī)制的抗腫瘤藥物，雖然在體外實(shí)驗(yàn)中能有效的殺傷腫瘤細(xì)胞，但因耐藥性的存在，其臨床效果不佳。因此，尋找逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤耐藥性的新策略或增強(qiáng)化療藥物的敏感性，對(duì)膠質(zhì)瘤治療十分重要，也是目前臨床試驗(yàn)的重點(diǎn)。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)星形細(xì)胞是否影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，探討星形細(xì)胞影響膠質(zhì)瘤耐藥性的內(nèi)在機(jī)制，深入理解腫瘤微環(huán)境對(duì)膠

3、質(zhì)瘤耐藥性的影響，從而為膠質(zhì)瘤耐藥性新治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)、尋找更為有效的控制腫瘤的策略、提高膠質(zhì)瘤治療療效提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法和結(jié)果：1.人星形細(xì)胞通過(guò)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞直接接觸降低其對(duì)化療藥物的敏感性
　　為檢測(cè)星形細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤耐藥性的影響，我們建立星形細(xì)胞和CFSE標(biāo)記的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)模型，應(yīng)用AnnexinⅤ/PI方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與人星形細(xì)胞共培養(yǎng)后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172的凋亡比例下降約

4、50％，提示星形細(xì)胞能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物TMZ和VCR的敏感性。
　　為檢測(cè)星形細(xì)胞是通過(guò)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞直接接觸還是通過(guò)分泌細(xì)胞因子發(fā)揮化療保護(hù)作用，我們建立直接接觸和transwell間接共培養(yǎng)模型。結(jié)果顯示，星形細(xì)胞的化療保護(hù)作用依賴(lài)于星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間的直接接觸。
　　2.星形細(xì)胞通過(guò)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成縫隙連接通道（gap junctionalcommunication，GJC）提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的耐藥性
　

5、　縫隙連接通道(GJC)是細(xì)胞間直接接觸形成一個(gè)重要結(jié)構(gòu)，在腫瘤細(xì)胞的凋亡和死亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)dye transfer實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞間是否存在通過(guò)GJC的物質(zhì)交換;通過(guò)加入GJC阻斷劑CBX，檢測(cè)星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞間形成的GJC對(duì)膠質(zhì)瘤耐藥性的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞間存在通過(guò)GJC的小分子物質(zhì)交換，而且該過(guò)程可被CBX阻斷;在直接接觸共培養(yǎng)組中加入CBX阻斷星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤

6、細(xì)胞間的GJC，能逆轉(zhuǎn)星形細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤的化療保護(hù)作用，提示星形細(xì)胞通過(guò)與膠質(zhì)瘤形成GJC提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的耐藥性。
　　3.GJC介導(dǎo)的星形細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤的化療保護(hù)作用依賴(lài)于連接蛋白43(connexin43，Cx43)
　　在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和膠質(zhì)瘤中，連接蛋白43(Cx43)是構(gòu)成GJ的主要蛋白。我們通過(guò)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)星形細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞Cx43的表達(dá)情況;通過(guò)小干擾RNA技術(shù)敲低A172細(xì)胞Cx43表達(dá)后與星形細(xì)胞進(jìn)行d

7、ye transfer實(shí)驗(yàn)和共培養(yǎng)凋亡實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)Cx43對(duì)這兩種細(xì)胞間物質(zhì)交換和凋亡的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，星形細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞均表達(dá)Cx43，兩種細(xì)胞間可形成GJC;將膠質(zhì)瘤細(xì)胞敲低Cx43后與星形細(xì)胞共培養(yǎng)，其染料傳遞比例明顯下降，并且與CBX組相比無(wú)顯著性差異，提示Cx43可能是構(gòu)成星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞間功能性GJC的主要蛋白。同時(shí)流式結(jié)果顯示，共培養(yǎng)組中轉(zhuǎn)染siCx43的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡水平與單獨(dú)培養(yǎng)組相比，無(wú)顯著性差

8、異，并且加入CBX不顯著影響其凋亡水平。以上結(jié)果提示GJC介導(dǎo)的星形細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤的化療保護(hù)作用是依賴(lài)于Cx43的。
　　4.星形細(xì)胞通過(guò)GJC調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、防止鈣超載，降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性
　　鈣離子是可通過(guò)GJ在細(xì)胞間進(jìn)行傳遞的重要的第二信使，在激活和執(zhí)行細(xì)胞凋亡和死亡中起關(guān)鍵作用。我們通過(guò)Fluo-3AM標(biāo)記法，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及變化，驗(yàn)證Ca+在星形細(xì)胞調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)

9、胞凋亡中起關(guān)鍵作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞的Ca2+濃度隨細(xì)胞凋亡的升高而升高，并且加入Ca2+螯合劑BAPTA能降低化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;星形細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度要顯著低于A(yíng)172單獨(dú)培養(yǎng)組;與星形細(xì)胞共培養(yǎng)后，A172細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度降低，共培養(yǎng)組細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度聚集速度要顯著慢于單獨(dú)培養(yǎng)組，并且該過(guò)程可被CBX阻斷。以上結(jié)果提示，在化療藥物作用下，星形細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度不平衡，可能存在通過(guò)GJC的

10、Ca2+流。因此，星形細(xì)胞可能通過(guò)GJC調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，防止鈣超載，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：1.腫瘤微環(huán)境中的星形細(xì)胞能降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物TMZ和VCR的敏感性。
　　2.星形細(xì)胞通過(guò)與膠質(zhì)瘤細(xì)胞直接接觸形成GJC，調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，防止鈣超載，降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。
　　3.星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞間的GJC依賴(lài)于Cx43。
　　4.星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞間存在相互作用，臨床

11、應(yīng)用化療藥物治療膠質(zhì)瘤時(shí)應(yīng)考慮星形細(xì)胞的影響，可聯(lián)合應(yīng)用GJC阻斷劑CBX，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。
　　5.星形細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞間的Cx43—GJC可作為膠質(zhì)瘤耐藥性治療的新靶點(diǎn)。
　　第二部分 星形細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤遷移和侵襲的影響及其機(jī)制研究
　　背景：膠質(zhì)瘤的侵襲特性，使手術(shù)完全切除十分困難并介導(dǎo)對(duì)目前治療手段的耐受性，是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后差的主要原因。因此，制定新策略治療膠質(zhì)瘤的侵襲特性或深入理解調(diào)控膠質(zhì)瘤侵襲

12、的機(jī)制，對(duì)膠質(zhì)瘤的治療極為關(guān)鍵。
　　越來(lái)越多的研究顯示，腫瘤微環(huán)境尤其是腫瘤基質(zhì)細(xì)胞影響腫瘤的惡性生物學(xué)行為。而星形細(xì)胞是人腦中數(shù)目最多的膠質(zhì)細(xì)胞，是膠質(zhì)瘤微環(huán)境中重要的基質(zhì)細(xì)胞群。有研究顯示，星形細(xì)胞能增強(qiáng)膠質(zhì)母干樣細(xì)胞的侵襲能力，并在腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成中起重要作用。此外，星形細(xì)胞還能通過(guò)分泌大量細(xì)胞因子影響腫瘤的增殖和侵襲能力。膠質(zhì)瘤微環(huán)境中的另一種基質(zhì)細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞，影響膠質(zhì)瘤侵襲的機(jī)制已經(jīng)得到深入闡述，但星形細(xì)胞對(duì)

13、膠質(zhì)瘤侵襲的影響及機(jī)制研究仍較少。
　　MMP14是MMP家族的一種跨膜蛋白，能通過(guò)裂解膜表面糖蛋白CD44或通過(guò)與TIMP-2結(jié)合為復(fù)合物進(jìn)而激活MMP2或MMP9，促進(jìn)腫瘤的遷移和侵襲。研究顯示，多種侵襲性腫瘤和基質(zhì)細(xì)胞的MMP14表達(dá)上調(diào)，并且小膠質(zhì)細(xì)胞或膠質(zhì)瘤細(xì)胞的MMP14逐漸成為膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)。IL-6是一種調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子。近年來(lái)有研究顯示，IL-6能通過(guò)增強(qiáng)MMP2和MMP9的活性促進(jìn)膠質(zhì)瘤的遷移和

14、侵襲，因此，IL-6可能通過(guò)影響MMP14的活性或表達(dá)來(lái)調(diào)控MMP2或MMP9的活性?；谝陨涎芯?，我們提出:星形細(xì)胞能通過(guò)分泌大量細(xì)胞因子如IL-6來(lái)調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP14的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的遷移和侵襲能力。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)研究腫瘤微環(huán)境中的星形細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤遷移和侵襲特性的影響，深入探究星形細(xì)胞促進(jìn)膠質(zhì)瘤遷移和侵襲的機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的臨床治療，尤其是對(duì)其侵襲特性的治療，提供新的治療靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法

15、和結(jié)果：1.人星形細(xì)胞提高膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲能力
　　通過(guò)transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)星形細(xì)胞對(duì)膠質(zhì)瘤遷移和侵襲特性的影響。結(jié)果顯示，人星形細(xì)胞能通過(guò)分泌細(xì)胞因子顯著提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和A172的遷移和侵襲能力。
　　2.星形細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子上調(diào)遷移和侵襲相關(guān)的基因和蛋白并激活相關(guān)信號(hào)通路
　　用星形細(xì)胞培養(yǎng)上清(ACM)分別刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和A172，qRT-PCR或Western blo

16、t方法檢測(cè)并篩選遷移和侵襲相關(guān)基因和蛋白如MMP和Rho家族，結(jié)果顯示MMP14表達(dá)上調(diào)最為顯著;檢測(cè)遷移和侵襲相關(guān)信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)ERK1/2、AKT和p38MAPK信號(hào)通路被激活。
　　3.星形細(xì)胞上清能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜表面MMP14的表達(dá)，并通過(guò)激活MMP2而不是裂解CD44，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲
　　用星形細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)膜蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜表面MMP14表達(dá)上升，而CD

17、44沒(méi)有變化。用小干擾RNA技術(shù)下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP14的表達(dá)，明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示其分泌的MMP2活性降低，transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示其遷移、侵襲能力明顯下降;而用ACM上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜表面MMP14表達(dá)后，其分泌的MMP2活性上升。以上結(jié)果提示星形細(xì)胞能通過(guò)分泌細(xì)胞因子上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜表面MMP14的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)激活MMP2而不是裂解CD44促進(jìn)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲能力。
　　結(jié)論：1.星形細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子上調(diào)膠質(zhì)瘤