蟾毒它靈對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的作用及機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分，蟾毒它靈在體外對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用的評(píng)價(jià)
　　目的：在體外培養(yǎng)環(huán)境下,了解蟾毒它靈對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用及IC50濃度區(qū)間,初步了解蟾毒它靈對(duì)U87細(xì)胞侵襲能力和細(xì)胞周期的影響。
　　方法：運(yùn)用XTT法測(cè)定蟾毒它靈對(duì)U87、U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)抑制的量-時(shí)-效關(guān)系。運(yùn)用XTT法分別測(cè)定不同濃度蟾毒它靈作用于原代培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞Jz001和JZ002以及人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87和U251的72小時(shí)生長(zhǎng)

2、抑制率。正規(guī)幾率單位法計(jì)算蟾毒它靈對(duì)每種細(xì)胞的IC50。TRANSWELL法測(cè)定不同濃度蟾毒它靈對(duì)U87細(xì)胞侵襲能力的影響。流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定不同濃度蟾毒它靈對(duì)U87細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果：藥物干預(yù)后24、48和72小時(shí),各濃度蟾毒它靈對(duì)人膠質(zhì)細(xì)胞的增殖抑制作用趨勢(shì)接近。在體外培養(yǎng)環(huán)境下,不同濃度的蟾毒它靈作用72小時(shí)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性有較大差異,對(duì)Jz001的IC50為0.063ug/ml,對(duì)JZ002的IC50為0

3、.084ug/ml,對(duì)U87的IC50為0.071ug/ml,對(duì)U251的IC50為0.145ug/ml。2-5ug/ml的蟾毒它靈就能明顯降低U87細(xì)胞的侵襲能力。2-2ug/ml蟾毒它靈作用24小時(shí)可以使U87細(xì)胞G2期和S期細(xì)胞比例明顯提高。
　　結(jié)論：蟾毒它靈在體外對(duì)多種人膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有很強(qiáng)的增殖抑制活性,蟾毒它靈對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用有明顯的劑量依賴性而時(shí)間相關(guān)性不明顯。U87細(xì)胞的侵襲能力和蟾毒它靈的濃度呈負(fù)相關(guān)

4、。蟾毒它靈可以通過G2/M期、S期細(xì)胞周期阻滯對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)揮增殖抑制作用。
　　第二部分，蟾毒它靈對(duì)人膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型的抗腫瘤效果研究
　　目的：建立U87原位種植動(dòng)物模型。了解經(jīng)血管給藥后,不同時(shí)間點(diǎn)蟾毒它靈在小鼠腦內(nèi)的分布情況；比較蟾毒它靈和陽性對(duì)照藥物替莫唑胺對(duì)U87荷瘤小鼠的療效優(yōu)劣。
　　方法：采用高效液相色譜法測(cè)定經(jīng)尾靜脈給藥后不同時(shí)間點(diǎn)(15min、30min、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)和2

5、4小時(shí))的小鼠腦組織內(nèi)蟾毒它靈含量的變化；立體定位注射技術(shù)建立U87原位種植裸鼠模型,并分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組。對(duì)照組(n=15)給予每周兩次尾靜脈注射藥物溶劑、實(shí)驗(yàn)組(n=14)給予每周兩次尾靜脈注射6mg/Kg蟾毒它靈,陽性對(duì)照組(n=18)給予每日腹腔注射82.5mg/Kg替莫唑胺連續(xù)5天。治療開始后定期觀察小鼠體重變化,通過定期的增強(qiáng)磁共振掃描了解不同干預(yù)下活體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的差異,根據(jù)生存情況繪制生存曲線,比較不同干預(yù)對(duì)荷

6、瘤小鼠生存時(shí)間的影響。組織學(xué)和免疫組化染色驗(yàn)證不同干預(yù)對(duì)腫瘤的作用。
　　結(jié)果：成功建立了U87原位異體種植裸鼠模型。經(jīng)尾靜脈給藥后不同時(shí)間點(diǎn)蟾毒它靈在小鼠腦內(nèi)的含量測(cè)定表明,靜脈給藥后蟾毒它靈能通過血腦屏障進(jìn)入腦組織,并維持在0.1μ g/g的濃度之上超過16小時(shí)。陽性對(duì)照組小鼠在治療開始后1周左右的時(shí)間內(nèi),平均體重呈進(jìn)行性下降,停用TMZ后體重逐漸恢復(fù),對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠的平均體重在術(shù)后2周左右開始出現(xiàn)進(jìn)行性下降。定期的增強(qiáng)磁

7、共振掃描發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤逐漸增大,而陽性對(duì)照組在4周內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯強(qiáng)化的腫瘤信號(hào)。根據(jù)荷瘤小鼠生存情況繪制生存曲線發(fā)現(xiàn),對(duì)照組中位生存時(shí)間為21天,實(shí)驗(yàn)組中位生存時(shí)間25天,比較兩組生存時(shí)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.038),陽性對(duì)照組觀察超過4周無組內(nèi)樣本死亡。
　　結(jié)論：成功建立了穩(wěn)定的U87原位異體種植裸鼠模型,該模型方法便捷,成瘤率穩(wěn)定,是很好的評(píng)價(jià)化療藥物體內(nèi)效果的動(dòng)物模型。靜脈注射蟾毒它靈在小鼠腦內(nèi)分布良好,并且能夠

8、長(zhǎng)時(shí)間維持有效的治療濃度。增強(qiáng)磁共振掃描是一種安全直觀的活體觀察荷瘤小鼠腦內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)情況的方法。蟾毒它靈單獨(dú)應(yīng)用可以延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間。
　　第三部分，蟾毒它靈對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制作用機(jī)理的研究
　　目的：初步探索蟾毒它靈抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用機(jī)理以及膠質(zhì)瘤對(duì)其耐藥的機(jī)制。
　　方法：采用TUNEL/PI雙染法測(cè)定蟾毒它靈引起的DNA片段化；JC-1染色檢測(cè)蟾毒它靈對(duì)線粒體膜電位的影響；Western-Blot技術(shù)

9、檢測(cè)蟾毒它靈對(duì)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3pro-form、caspase-8、caspase-9、p53以及survivin含量的影響。對(duì)第二部分中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物腦組織切片行IHC染色,觀察P糖蛋白(P-Gp)的表達(dá)是否存在差異。
　　結(jié)果：蟾毒它靈作用24小時(shí)即可引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體膜電位下降和DNA的片段化；蟾毒它靈作用36小時(shí)后即可使膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)入不可逆的凋亡,細(xì)胞內(nèi)凋亡執(zhí)行酶Caspase-3前體的含量隨蟾毒

10、它靈的濃度升高而下降；代表死亡受體通路激活的Caspase-8和代表線粒體通路激活的Caspase-9的含量隨蟾毒它靈的濃度增高而增高,p53和survivin在U87細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較低,蟾毒它靈的濃度對(duì)這兩種蛋白表達(dá)的影響不明顯。IHC染色發(fā)現(xiàn)蟾毒它靈干預(yù)后膠質(zhì)瘤細(xì)胞P-糖蛋白(P-Glycoprotein)的表達(dá)較對(duì)照組增高。
　　結(jié)論：蟾毒它靈短時(shí)間作用就可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡過程,并且死亡受體通路和線粒體通路都參與了