RTN4表達(dá)調(diào)控膠質(zhì)瘤惡性增殖行為的實(shí)驗(yàn)研究及機(jī)制探討.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是一類惡性程度較高，具有高侵襲性，高復(fù)發(fā)率及高致死率的疾病。近年來，雖然膠質(zhì)瘤的診斷治療得到不斷的增強(qiáng)。但其患者的預(yù)后仍未得到明顯的改善。近年來，人們對膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制闡述逐漸深入發(fā)現(xiàn)，大部分膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中，RB，PI3K，P53這3條通路的異常改變參與其中。因此，尋找該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵調(diào)控分子，抑制膠質(zhì)瘤的形成與發(fā)展，從而為臨床提供準(zhǔn)確有效的治療靶標(biāo)，目前已成為了神經(jīng)外科領(lǐng)域所關(guān)注的熱點(diǎn)問題。
　　 RTN4是網(wǎng)狀蛋白

2、家族的成員之一，包含三個(gè)剪切變體:RTN4A，RTN4B，RTN4C，每個(gè)剪切變體在不同的細(xì)胞中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，廣泛地參與了細(xì)胞分化成熟，增殖，凋亡，遷移，粘附，侵襲等各項(xiàng)功能的調(diào)控。既往研究認(rèn)為，RTN4在膠質(zhì)瘤中屬于腫瘤抑制基因，其剪切變體RTN4A，RTN4B，RTN4C均有報(bào)道在細(xì)胞生長中起抑制作用，但目前有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RTN4A在膠質(zhì)瘤中普遍存在表達(dá)，部分甚至存在過表達(dá)。作為腫瘤抑制基因，為何會(huì)在膠質(zhì)瘤中過表達(dá)，其對腫瘤發(fā)

3、生發(fā)展的功能影響及意義仍不為人知?；仡櫸墨I(xiàn)，目前關(guān)于RTN4及膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為如增殖凋亡，侵襲遷移方面的研究較少。因此本實(shí)驗(yàn)擬從組織水平、細(xì)胞水平和動(dòng)物水平，通過定量RT-PCR、慢病毒RNA干擾，MTT增殖曲線，克隆形成，細(xì)胞周期等方法，研究RTN4及其剪切變體調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)特性的病理機(jī)制。
　　 第一部分:RTN4在腦膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)及與病理類型的關(guān)系
　　 目的:RTN4是網(wǎng)狀蛋白家族的成員之

4、一，其廣泛地參與了細(xì)胞的各種生物學(xué)行為的調(diào)控過程。但是目前，關(guān)于RTN4在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況仍不為人知。本部分利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR的方法，研究RTN4在腦膠質(zhì)瘤組織和U251，U87，U373，A172細(xì)胞系中的表達(dá)，并探索RTN4表達(dá)量與膠質(zhì)瘤病理類型的相關(guān)性。
　　 方法:1）收集病理證實(shí)（參照2007 WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤診斷分類標(biāo)準(zhǔn)）為膠質(zhì)瘤的臨床液氮凍存標(biāo)本10例（Ⅰ級1例，Ⅱ級2例，Ⅲ級3例，Ⅳ級4例），采用實(shí)

5、時(shí)定量RT-PCR方法檢測各例標(biāo)本中RTN4 mRNA的表達(dá)量，分析其與病理級別及組織類型的相關(guān)性。2）利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測RTN4 mRNA在A172，U373，U251和U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中的表達(dá)，比較膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中RTN4的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，RTN4表達(dá)普遍存在，部分標(biāo)本中，RTN4呈現(xiàn)明顯的過表達(dá)。通過半定量RT-PCR方法，與內(nèi)參β-actin蛋白比較，3例低級別膠質(zhì)瘤平均表達(dá)水平為1.7

6、6±1.44，7例高級別膠質(zhì)瘤平均表達(dá)水平為2.34±2.53。RTN4在高低級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。少突膠質(zhì)瘤細(xì)胞(4.67±4.75)與星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞（1.54±0.85）之間的RTN4表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在四組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，RTN4亦存在表達(dá)，但四組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系間RTN4表達(dá)具有明顯差異(P＜0.05)，兩兩細(xì)胞系之間的RTN4表達(dá)均不相同。
　　 結(jié)論:在膠質(zhì)瘤標(biāo)本及細(xì)胞系中，均存在RTN4表達(dá)，部分標(biāo)

7、本或細(xì)胞系中，RTN4存在明顯過表達(dá)。RTN4表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理等級無明顯關(guān)聯(lián)。然而在膠質(zhì)瘤的組織類型上存在差異。作為腫瘤抑制因子，其在腫瘤中的表達(dá)增加的意義和作用以及其在腫瘤組織類型上的鑒別意義有待我們繼續(xù)研究證實(shí)。
　　 第二部分:構(gòu)建靶向RTN4的干擾shRNA慢病毒載體
　　 目的:前期實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)，RTN4在膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及細(xì)胞系中存在不同程度的表達(dá)，部分過表達(dá)，然而，一個(gè)抑癌基因其在腫瘤中高表達(dá)的作用仍是未知。

8、為了探尋RTN4在膠質(zhì)瘤中的作用，我們擬先建立shRNA穩(wěn)定干擾RTN4表達(dá)病毒載體。
　　 方法:1）利用shRNA設(shè)計(jì)軟件，選取合適的shRNA序列，采用基因重組技術(shù)插入質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入細(xì)胞表達(dá)擴(kuò)增。2）對建立的shRNA質(zhì)粒進(jìn)行測序，并且將其轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞系，通過RT-PCR觀察其對RTN4表達(dá)的抑制情況
　　 結(jié)果:根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)shRNA序列及shCON序列，成功將其插入pGPU6/GFP/N

9、eo質(zhì)粒中。將其轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞系后測序證實(shí)RNA干擾質(zhì)粒中shRNA干擾序列與設(shè)計(jì)一致。RT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，轉(zhuǎn)染shRNA的U251細(xì)胞與轉(zhuǎn)染shCON的細(xì)胞相比，RTN4 mRNA的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)中成功地構(gòu)建了可穩(wěn)定干擾RTN4 mRNA表達(dá)的慢病毒載體。
　　 第三部分:RTN4調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:RTN4廣泛參與多種細(xì)胞生物

10、學(xué)行為的調(diào)控過程。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)RTN4在膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)過表達(dá)。但其在膠質(zhì)瘤中具體發(fā)揮的功能仍是未知。本部分采用穩(wěn)定改變內(nèi)源性RTN4表達(dá)水平的RNA干擾慢病毒載體，研究RTN4對于腦膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為的作用。
　　 方法:靶向RTN4穩(wěn)定RNA干擾載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251、U87及U373細(xì)胞，采用RT-PCR驗(yàn)證干擾的有效性。采用MTT法檢測細(xì)胞生長曲線變化，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的克隆形成能力改變，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期的

11、變化。繼而通過WesternBlot實(shí)驗(yàn)檢測RTN4可能調(diào)控的下游分子的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:使用shRNA干擾膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的RTN4 mRNA表達(dá)，U251，U87及U373膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力下降，克隆形成能力減弱。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RTN4表達(dá)下降后，U251細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻斷于G0/G1期，進(jìn)入分裂期的細(xì)胞數(shù)明顯減少。Western Blot檢測9種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn)，RTN4下調(diào)伴隨著CDK4及CDC25A的下調(diào)