酸感受器GPR65調(diào)控膠質(zhì)瘤惡性增殖機(jī)制及預(yù)后相關(guān)性研究.pdf

1、背景及目的:腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，約占腦內(nèi)所有惡性腫瘤的80％，其中惡性程度和發(fā)病率最高者(65％)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM，WHOⅣ級）。其預(yù)后不佳，死亡率極高，使惡性膠質(zhì)瘤成為目前神經(jīng)外科疾病治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)的治療策略包括手術(shù)切除及輔以術(shù)后放化療，以替莫唑胺(TMZ)聯(lián)合放療為標(biāo)準(zhǔn)方案的術(shù)后輔助治療也在一定程度上延長了患者總體生存時間(OS)。然而由于膠質(zhì)瘤高度復(fù)發(fā)、惡性侵襲的特性及TMZ等化療藥耐藥等因

2、素，GBM和間變型膠質(zhì)細(xì)胞瘤（WHOⅢ級）患者中位生存時間仍然分別只有12～15個月和2～5年。如何改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后一直是神經(jīng)外科領(lǐng)域的難題。
　　隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，對與腫瘤發(fā)生過程中的基因事件及分子機(jī)制的研究也更加深入，靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)核心信號通路中的關(guān)鍵分子，抑制受體激活、阻斷信號傳導(dǎo)等，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。由此，闡明膠質(zhì)瘤的分子病理機(jī)制，尋找能夠有效治療膠質(zhì)

3、瘤的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)顯得十分重要。
　　高通量技術(shù)的快速發(fā)展無疑為實現(xiàn)分子靶向治療提供了強(qiáng)有力的支持。利用二代測序、基因芯片、組織芯片等技術(shù)，分析腫瘤樣本中基因及分子水平變化，結(jié)合詳細(xì)患者隨訪資料，比較病例的療效及生存時間迥異，進(jìn)而篩選出差異表達(dá)基因，是尋找腫瘤分子靶標(biāo)的可靠手段。TCGA數(shù)據(jù)庫即是在此背景下由美國國家癌癥研究所和美國國家人類基因組研究所于2005年共同發(fā)起建立，旨在通過高通量技術(shù)研究加深對腫瘤分子基礎(chǔ)的理解，而GBM

4、是該項目重點(diǎn)聚焦并最先開展深入研究的腫瘤。通過聚類分析、差異表達(dá)分析和生存分析，整合腦膠質(zhì)瘤患者的基因芯片數(shù)據(jù)及TCGA數(shù)據(jù)庫中GBM樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和患者臨床相關(guān)資料，以此尋找那些在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)異常并與患者預(yù)后相關(guān)的基因。這些結(jié)果不僅能夠有助于我們理解腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子病理機(jī)制，同時還可能揭示一些對腦膠質(zhì)瘤預(yù)后有判斷價值的分子標(biāo)記物，進(jìn)而幫助實現(xiàn)真正意義上的個體化治療。
　　G-蛋白偶聯(lián)受體-65(GPR65)為G-蛋白偶

5、聯(lián)受體(GPCRs)家族中的一個重要成員，是一類敏感的質(zhì)子傳感器。既往研究顯示惡性腫瘤細(xì)胞生長代謝迅速，造成氧乏進(jìn)入糖酵解途徑產(chǎn)能，含有大量乳酸的代謝產(chǎn)物堆積，使得腫瘤細(xì)胞周圍形成微酸性環(huán)境。GRP65能夠感受這種細(xì)胞外環(huán)境中pH的變化，及時調(diào)整下游能量代謝和協(xié)調(diào)炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過程，從而使腫瘤細(xì)胞獲得更多的生存優(yōu)勢，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。然而，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)中均無GPR65在膠質(zhì)瘤中相關(guān)的研究報道。我們擬通過數(shù)據(jù)庫及多樣本信息篩選及驗

6、證GPR65對膠質(zhì)瘤患者預(yù)后判斷的價值，并利用體外實驗研究GPR65在膠質(zhì)瘤惡性增殖中的作用機(jī)制。研究方法及結(jié)果:
　　前期我們收集了15例的膠質(zhì)瘤樣本，經(jīng)病理證實WHOⅠ級1例，WHOⅡ級7例，WHOⅢ級2例及WHOⅣ級5例，并對患者進(jìn)行隨訪獲得生存期，截止隨訪終點(diǎn)，共有7名患者死亡，8名患者仍健在，15名患者生存期為5-85個月，中位生存時間65個月。繼而將腫瘤組織裂解、抽提RNA及轉(zhuǎn)化cDNA，制備成基因芯片，通過雜交測序方

7、法獲得表達(dá)譜基因信號值。根據(jù)患者隨訪截止時的生存狀態(tài)分組，對兩組患者的每個基因進(jìn)行t檢驗、差異倍數(shù)計算及熱圖分析，在p值小于0.015水平，兩組間基因表達(dá)差異2倍時，發(fā)現(xiàn)134個基因能夠明確區(qū)分預(yù)后不同的兩組膠質(zhì)瘤患者。在TCGA的528例GBM及10例正常腦組織中，我們利用秩和檢驗、Kaplan-Meier生存分析及l(fā)og-rank檢驗來驗證這134個基因在腫瘤中的表達(dá)及與患者生存期的相關(guān)性。經(jīng)過逐個基因驗證分析，我們發(fā)現(xiàn)GPR65在

8、GBM組織中表達(dá)明顯上調(diào)(p＜0.001)，并與患者的生存期明顯相關(guān)，GPR65高表達(dá)者中位OS明顯短于低表達(dá)者（中位OS11.7個月vs.14.2個月，p=0.003）。通過在自主建立的基因芯片及公開的TCGA數(shù)據(jù)庫中初步篩選，我們發(fā)現(xiàn)GPR65基因在膠質(zhì)瘤中表達(dá)明顯上調(diào)，并可作為預(yù)后因子預(yù)測GBM患者預(yù)后，提示其可能在膠質(zhì)瘤發(fā)生及進(jìn)展過程中扮演重要角色。
　　隨后，我們收集經(jīng)病理證實的300例膠質(zhì)瘤樣本（WHOⅠ級11例，WH

9、OⅡ級109例，WHOⅢ級47例，WHOⅣ級133例）及16例正常腦組織制備成高通量組織芯片，并對腦膠質(zhì)瘤患者跟蹤隨訪，再利用免疫組化的方法進(jìn)一步驗證GPR65的表達(dá)及預(yù)后判斷作用。隨訪結(jié)果顯示285名患者獲得完整隨訪數(shù)據(jù)，截止2013年9月隨訪結(jié)束，39.3％患者仍存活，35.4％患者影像學(xué)未見明顯腫瘤復(fù)發(fā)，患者中位總體生存時間(OS)為30個月，中位無進(jìn)展生存期(PFS)為26個月。免疫組化顯示GPR65主要定位于靶細(xì)胞的細(xì)胞漿，其

10、在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)水平明顯上調(diào)（免疫組化得分4.295±3.063 vs.1.00±1.225，p＜0.001）。Kaplan-Meier生存曲線顯示117例GPR65高表達(dá)患者的中位OS及中位PFS均明顯短于164例GPR65低表達(dá)患者（OS:15個月vs.34個月，p＜0.001; PFS:12個月vs.30個月，p＜0.001）。進(jìn)一步的分層分析指出，在102例原發(fā)GBM患者中，GPR65的高表達(dá)(58/102)也預(yù)示著較短的中位O

11、S及中位PFS（OS:11個月vs.14個月，p=0.01; PFS:8個月vs.11個月，p=0.022）。多因素Cox比例風(fēng)險回歸顯示，GPR65表達(dá)是原發(fā)GBM患者OS(Hazard Ratio=1.599,95％CI1.028-2.487, p=0.037)及PFS(HazardRatio=1.593，95％CI1.036-2.450，p=0.034)的獨(dú)立預(yù)測因子。
　　為了進(jìn)一步研究GPR65在膠質(zhì)瘤中多發(fā)揮的具體功能

12、，我們首先利用慢病毒感染的方法構(gòu)建了干擾和過表達(dá)GPR65基因及空載質(zhì)粒對照的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251。熒光顯微鏡、定量PCR及Western blot實驗證實GPR65干擾和過表達(dá)效果穩(wěn)定。繼而再通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖曲線變化、克隆形成實驗檢測腫瘤細(xì)胞克隆形成能力變化、流式細(xì)胞儀測腫瘤細(xì)胞周期比例變化等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)改變內(nèi)源性GPR65表達(dá)水平后，對空載質(zhì)粒對照組相比，GPR65過表達(dá)可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及提高克隆形成能力;GPR65