HPPCn蛋白純化及其與膠質(zhì)瘤增殖的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的原發(fā)性顱腦腫瘤之一，約占原發(fā)性腦腫瘤的60％～70%。膠質(zhì)瘤因其復(fù)雜的定位、侵襲性生物學(xué)行為、彌漫性浸潤性生長和有限的外科手術(shù)治療方案，進(jìn)而面臨治療上的諸多困難與挑戰(zhàn)。膠質(zhì)瘤主要給予安全的手術(shù)切除繼而給予放化療，但是仍然有超過90%的膠質(zhì)瘤病人會復(fù)發(fā)，中位生存期僅為15-18個月。目前研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤在增殖、分化、凋亡等重要生物學(xué)過程中存在多個基因位點的突變，缺乏正常的基因調(diào)

2、控，從而出現(xiàn)細(xì)胞的惡性增殖和侵襲性生長。腫瘤的形成是一個循序漸進(jìn)的過程，涉及到多種反應(yīng)過程，目前對導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞惡性增殖的機制尚不十分清楚。電離輻射、化學(xué)物質(zhì)以及遺傳等都是膠質(zhì)瘤發(fā)生的危險因素。為進(jìn)一步了解膠質(zhì)瘤的發(fā)生機制，進(jìn)而改善膠質(zhì)瘤的治療效果，研究者一直都在尋找與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有著千絲萬縷聯(lián)系的分子標(biāo)志物。HPPCn是一種新型的肝細(xì)胞刺激因子，屬于酸性核磷蛋白32家族成員，ANP32家族蛋白是一類進(jìn)化上高度保守的多功能蛋白，其功能

3、涉及到增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞運動等多種不同的生物學(xué)事件。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn) HPPCn與肝癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。前期研究中，我們采用人多組織芯片分析結(jié)果顯示 HPPCn呈多組織分布，但是在腦組織中表達(dá)水平最高。因此，我們有理由相信HPPCn與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生具有一定的相關(guān)性。
　　實驗方法：
　　首先是高純度 HPPCn蛋白的獲得，采用一種新的冷休克表達(dá)系統(tǒng)，通過無縫克隆技術(shù)，

4、構(gòu)建人 pColdⅡ/HPPCn重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，根據(jù) HPPCn的分子量、等電點等特性，采用鎳離子親和層析對重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，考馬斯亮藍(lán)染色測定蛋白濃度，Image Quant LAS4000凝膠掃描分析蛋白純度，Western blot分析重組蛋白特異性，對最終純化產(chǎn)物進(jìn)行體外功能學(xué)研究。
　　體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，研究HPPCn在體外實驗中對U251細(xì)胞系是否具有作用，并且觀察HPP

5、Cn對U251細(xì)胞的化療藥物替莫唑胺是否具有增敏作用，以 HPPCn刺激單用作為兩者聯(lián)合用藥的對照組，再通過細(xì)胞增殖實驗觀察細(xì)胞增殖抑制。
　　臨床收集膠質(zhì)瘤樣本40例，按照WHO對腫瘤的分級標(biāo)準(zhǔn)對收集的膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行分級，提取樣本組織總RNA，對剩余樣本常規(guī)多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色。通過RT-PCR檢測膠質(zhì)瘤樣本HPPCn mRNA的表達(dá)量，免疫組織化學(xué)染色檢測HPPCn蛋白在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)。
　　結(jié)果：

6、
　　第一部分：本實驗采用新的表達(dá)載pColdⅡ，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。HPPCn蛋白在0.1mmol/L的IPTG、培養(yǎng)溫度16℃、過夜誘導(dǎo)時為可溶性表達(dá)，采用鎳離子親和層析純化得到HPPCn的純度達(dá)到95%，蛋白總量和純度均達(dá)到了體內(nèi)外活性研究的要求。
　　第二部分：在HPPCn蛋白單獨作用時，U251細(xì)胞的增值活性（1.79±0.03、1.68±0.02、1.62±0.09、1.57±0.01、1.4

7、6±0.01）隨著HPPCn濃度（0、10、50、100、200ng/ml）的增加而逐漸下降。同時，在替莫唑胺化療的同時外源性補充 HPPCn的條件下，其細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞活性顯著低于替莫唑胺單用對照組。RT-PCR檢測人膠質(zhì)瘤樣本中HPPCn的mRNA表達(dá)，隨著膠質(zhì)瘤WHO級別的升高，HPPCn的表達(dá)水平逐漸增加。與Ⅲ級、Ⅳ級膠質(zhì)瘤相比，Ⅰ級、Ⅱ級膠質(zhì)瘤中HPPCn mRNA的表達(dá)水平均較低（P<0.05），其中Ⅳ級膠質(zhì)瘤HPPCn

8、mRNA表達(dá)量最高。免疫組織化學(xué)染色檢測膠質(zhì)瘤樣本病理切片中HPPCn的表達(dá)，HPPCn在40例腦膠質(zhì)瘤樣本中表達(dá)水平較高，陽性率達(dá)到72.5%。在22例惡性程度低（Ⅰ+Ⅱ）的組織中，HPPCn陽性表達(dá)13例，占59.10%；而在18例高級別（Ⅲ+Ⅳ）膠質(zhì)瘤中，HPPCn陽性表達(dá)16例，占88.89%，HPPCn的陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在性別分組比較中，男性組的陽性率為66.67%，與女性組（63.16%）無顯著差異

9、，大于50歲（64.28%）和小于等于50歲組（57.70%）的陽性率也無顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．運用冷休克表達(dá)載體pColdⅡ和無縫克隆技術(shù)成功構(gòu)建了HPPCn的重組表達(dá)質(zhì)粒，HPPCn蛋白在大腸桿菌表達(dá)體系為可溶性表達(dá)，最終獲得HPPCn純度達(dá)到95%，符合體內(nèi)外實驗的標(biāo)準(zhǔn)。
　　2.HPPCn蛋白對U251細(xì)胞具有增殖抑制作用，同時對U251細(xì)胞具有化療增敏性作用。
　　3.HPP