NAD(P)H氧化酶在膠質瘤的表達及與其惡性程序相關性研究.pdf

1、背景:近年來，顱內腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢，據(jù)統(tǒng)計，顱內腫瘤約占全身腫瘤的5％，占兒童腫瘤的70％，最常見的腦瘤是腦膠質瘤(glioma)。腦膠質瘤約占顱內腫瘤的40％-45％，來源于各型膠質細胞。而廣義上，腦膠質瘤應包括整個神經上皮組織來源的各型膠質細胞和神經元的腫瘤包括髓上皮瘤、髓母細胞瘤、膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、少枝膠質瘤、室管膜瘤等;按腫瘤惡性程度可以將膠質瘤分成(Ⅰ-Ⅳ)四級。
　　 臨床上腦膠質瘤臨床表現(xiàn)主要包括顱內高

2、壓癥狀和病變局部癥狀。膠質瘤引起顱內壓增高的機制有:腫瘤實質占位;腫瘤周圍水腫;腫瘤囊變或出血;腫瘤顱高壓癥狀出現(xiàn)的早晚、發(fā)展的快慢、以及輕重，取決于腫瘤的生長速度、位于腦脊液通路周圍或回流靜脈旁或顱后窩等情形。膠質瘤的臨床表現(xiàn)是重要的鑒別依據(jù)，此外神經影像學依據(jù)有包括病變所在部位，病變信號，病變內部質地，周邊形態(tài)，強化情況，周圍腦結構等情況對確定病變性質和范圍，制定治療方案具有重要意義。
　　 關于腦膠質瘤的治療，首先是手術治

3、療，對于原發(fā)性腫瘤，予以外科手術切除，盡可能將腫瘤細胞移除干凈，避免細胞增生仍是最普遍的治療模式。對于良性腫瘤，采用手術完全切除的機率較高，病人的存活率也較高。但是對于惡性程度較高的特別是WHO分級Ⅲ級以上的腫瘤，鑒于膠質瘤細胞侵襲性生長以及異常的生物學特性，對放化療的不敏感，治療效果不佳;而且經常以同級別或高級別復發(fā)，增加了病人的痛苦和經濟負擔。因此通過臨床實驗和基礎研究分析膠質瘤惡性表型對于治療具有重要意義。
　　 腫瘤發(fā)生

4、是多種因素引起。有實驗證明，應用自由基清除劑和抗氧化劑在整體或體外實驗中都有抑制某些致癌作用。這提示體內過多的自由基可能通過某些機制引起組織細胞結構和功能改變，生長水平上失去了控制，由此引起和促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展和惡化?；钚匝?ReactiveOxygenSpecies，ROS)是指化學性質活躍的含氧原子或原子團，包括超氧陰離子自由基、過氧化氫(H2O2)、脂過氧化自由基等。細胞內活性氧產生的酶體主要有NADPH氧化酶(Nicotinam

5、idevadeninedinucleotidephosphateoxidase，NOX)、黃瞟嶺氧化酶等，其中NOX是細胞中ROS的主要來源。ROS被認為是細胞代謝的有毒副產物，可以直接與脂質、蛋白、DNA等分子相互作用，導致組織學改變和功能異常。目前越來越多的研究表明，ROS在低濃度可作為信號轉導分子，參與機體多種細胞病理生理反應過程。研究顯示在膠質瘤細胞的惡性轉化過程中，細胞內ROS也明顯增加，提示ROS在上述病理生理反應中可能起了

6、重要作用。研究認為，ROS可以活化蛋白激酶、轉錄因子和基因表達等。NADPH氧化酶是細胞內ROS的重要來源。通常情況下，該酶處于靜息狀態(tài)，在受到適當?shù)拇碳杆倩罨?。NADPH氧化酶可以和細胞內核酸、蛋白質、脂類和糖類等相互作用，造成細胞結構和功能改變，由此引起和促進腫瘤特別是膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　 基于上述研究背景，結合膠質瘤在臨床診斷和治療中所遇到的一些問題，本題通過收集臨床不同級別的膠質瘤病例和標本檢測NAD(P)H氧

7、化酶在不同惡性程度膠質瘤中的表達及ROS的含量，探討NAD(P)H氧化酶及細胞內ROS對對膠質瘤的發(fā)生發(fā)展的影響及其與膠質瘤惡性程度的相關性，以期進一步用于指導臨床膠質瘤的診斷和治療。
　　 目的:檢測NAD(P)H氧化酶及ROS在不同惡性程度膠質瘤中的表達，探討NAD(P)H氧化酶及細胞內ROS對膠質瘤發(fā)生增值及其與膠質瘤惡性程度的相關性。為膠質瘤患者的診斷和治療的臨床和基礎研究提供了新的思路。
　　 方法:收集200

8、7年8月2010年8月珠江醫(yī)院神經外科膠收治的不同級別的30膠質瘤病人組織標本，參照WHO公布的中樞神經系統(tǒng)腫瘤分類和惡性程度分級標準進行診斷和分級，以及10例對照組病人組織標本，病人年齡3～68歲，平均年齡38.5±14.8歲，收集上述腫瘤組織標本以及10例對照組病人組織標本，分為正常腦組織對照組(10例)、低級別膠質瘤(ⅠⅡ級共10例)、Ⅲ級膠質瘤(10例)和Ⅳ級膠質瘤(10例)。30例病例資料中男性18例，女性12例，各組病人性別

9、、年齡等資料比較差異無統(tǒng)計學意義，遵循均衡和隨機原則。通過:
　　 1.RealtimePCR的方法檢測組織(細胞)中NOX基因的表達量;
　　 2.carboxy-H2DCFDA測定組織ROS的含量;
　　 3.Westernblot和免疫熒光檢測組織中NOX的表達水平;
　　 4.結合合理的統(tǒng)計學分析方法;
　　 分析檢測NAD(P)H氧化酶及ROS在不同惡性程度膠質瘤中的表達，探討NAD(P

10、)H氧化酶及細胞內ROS與膠質瘤惡性程度的相關性。
　　 結果:
　　 1.RealtimePCR檢測膠質瘤組織細胞中NOXmRNA的表達水平
　　 本研究中40例標本分為正常對照組、低級別膠質瘤(ⅠⅡ級)、Ⅲ級膠質瘤和Ⅳ級膠質瘤，引入Taqman熒光探針，用realtimePCR的方法分析各組NOXmRNA的表達，選擇人GAPDH基因作為內參，結果提示40例標本均能檢測到NOXl-5mRNA有一定程度的表達，與

11、對照組差別有統(tǒng)計學意義，P＜0.001，但是，各組之間兩兩比較時，尤以NOX4在各實驗組的表達差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.001，提示正常對照組、低級別膠質瘤(ⅠⅡ級)、Ⅲ級膠質瘤和Ⅳ級膠質瘤隨著腫瘤分級的遞增，而NOX1、2、3、5的表達在不同惡性程度的腫瘤組織中的表達差異兩兩比較差別不具有統(tǒng)計學意義，P＞0.05。
　　 2.Carboxy-H2DCFDA測定組織ROS的產生
　　 膠質瘤組織加經過制備細胞懸液，并加入

12、含有最終濃度為10uM的carboxy-H2DCFDA的的溶液，用流式細胞儀檢測組織中ROS的含量，結果顯示，從正常對照組、低級別膠質瘤(ⅠⅡ級)、Ⅲ級膠質瘤和Ⅳ級膠質瘤隨著腫瘤分級的遞增，組織中ROS的含量的熒光強度隨著遞增，膠質瘤組織中ROS的生產水平增高。各腫瘤組與對照組相比差別具有統(tǒng)計學意義，P＜0.001，提示膠質瘤腫瘤較正常對照組ROS含量增高，不同級別之間腫瘤組織的ROS的含量差別亦具有統(tǒng)計學意義，P＜0.001，提示RO

13、S含量與腫瘤的惡性程度正相關。
　　 3.Westernblot檢測NOX的表達
　　 正常對照組和各級膠質瘤組織WesternBlot結果顯示，NOX蛋白在正常對照組標本中呈低表達或陰性，而在低級別膠質瘤(ⅠⅡ級)表達量增加，并且隨著腫瘤組織的惡性程度的遞增，如Ⅲ級膠質瘤和Ⅳ級膠質瘤NOX表達遞增，與對照組相比差別具有統(tǒng)計學意義，P＜0.001。這與通過熒光定量RT-PCR檢測膠質瘤組織細胞中NOXmRNA的表達水平的

14、趨勢一致。NOX蛋白在不同級別膠質瘤中表達量差異有統(tǒng)計學意義，提示該蛋白可能通過某些信號轉導途徑參與了腫瘤的惡性進展。
　　 4.免疫熒光檢測NOX的表達分布
　　 經過免疫熒光實驗結果可見，NOX蛋白在正常對照組標本中呈低表達甚至不表達，但是在低級別膠質瘤(ⅠⅡ級)、Ⅲ級膠質瘤和Ⅳ級膠質瘤組都看到有熒光結顯示，這提示在這些組織中有NOX蛋白，并且隨著惡性程度的增加，表達量相應增加，惡性程度越高，NOX表達水平越高。

15、r>　　 結論:對比正常對照組，惡性程度越高的膠質瘤NOX基因的表達水平增高，其中NOX4在不同惡性程度的膠質瘤的表達水平差異統(tǒng)計學意義;對比正常對照組，惡性程度越高的膠質瘤組織生成的ROS也增多。膠質瘤組織標本的中NOX基因的表達量以及ROS的含量與其惡性程度呈正相關。NOX4可能是膠質瘤組織中生產ROS的主要酶體，并且NOX4氧化酶及其生產的ROS可能對膠質瘤的存活和惡性增殖有著重要的調節(jié)作用，而且與膠質瘤的惡性程度密切相關。這一