自噬相關(guān)基因Beclin 1在子宮腺肌病中的作用及缺氧對Beclin 1影響的研究.pdf

1、為明確Beclin1在子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展中的作用及缺氧對其的影響，本文利用免疫組化、RT-PCR、蛋白免疫印跡和細胞培養(yǎng)等技術(shù)從以下幾個方面進行研究：1.Beclin1在子宮腺肌病在位內(nèi)膜中的表達及其臨床意義；2.Beclin1和HIF-1α在子宮腺肌病在位內(nèi)膜、病灶中的表達、臨床意義及相關(guān)性研究；3.Beclin1在子宮腺肌病在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的表達及缺氧對其的影響。
　　 第一部分 Beclin1在子宮腺肌病在位內(nèi)膜中的表達

2、及其臨床意義
　　 目的：探討自噬相關(guān)基因Beclin1在子宮腺肌病在位內(nèi)膜中的表達及其與臨床特征的相關(guān)性。
　　 方法：采用RT-PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測30例子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Beclin1 mRNA及蛋白的表達，并以32例正常子宮內(nèi)膜組織作為對照。
　　 結(jié)果：1.通過灰度分析，子宮腺肌病組Beclin1 mRNA相對表達量為（0.71±0.10），明顯低于對照組（0.93±0.10）（P＜O.0

3、01）。子宮腺肌病組Beclin1蛋白相對表達量為（0.82±0.22），明顯低于對照組（1.22±0.36）（P＜0.001）。2.內(nèi)膜Beclin1蛋白表達水平與血清中CA125水平呈負相關(guān)（n=62，r2=0.094，P=0.015），與盆腔疼痛亦呈負相關(guān)（n=62，r2=0.293，P=0.000）。
　　 第二部分 Beclin1和HIF-1α在子宮腺肌病在位內(nèi)膜、病灶中的表達、臨床意義及相關(guān)性研究
　　 目的

4、：探討B(tài)eclin1和HIF-1α在子宮腺肌病在位內(nèi)膜、病灶中的表達、臨床意義及其相關(guān)性。
　　 方法：采用免疫組化方法檢測53例子宮腺肌病在位內(nèi)膜組織中Beclin1和HIF-1α的表達，并以57例正常子宮內(nèi)膜組織作為對照，同時檢測30例病灶中Beclin1和HIF-1α的表達。
　　 結(jié)果：1.Beclin1蛋白在子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本中腺細胞和間質(zhì)細胞中均有表達，其表達主要見于細胞漿內(nèi)。HIF-1α蛋白在子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本

5、中腺細胞和間質(zhì)細胞中均有表達，其表達細胞漿、細胞核均有表達，在腺肌病病灶中以腺上皮表達為主，其表達主要見于細胞漿內(nèi)。2.在位腺肌病組Beclin1表達（3.62±2.69）顯著低于對照組Beclin1表達（10.32±4.12）（P＜0.01）。腺肌病病灶組Beclin1表達（0.27±0.52）顯著低于在位腺肌病組及對照組（P＜0.01）。在位腺肌病組HIF-1α表達（8.70±2.13）顯著高于對照組HIF-1α表達（4.49±2.

6、55）（P＜0.01）。腺肌病病灶組HIF-1α表達（7.97±2.54）顯著高于對照組（P＜0.01），與在位腺肌病組之間無顯著性差異。腺肌病組Beclin1表達增殖期與分泌期之間無顯著性差異，對照組Beclin1表達增殖期與分泌期之間無顯著性差異。增殖期Beclin1表達腺肌病組與對照組間有顯著性差異（P＜0.01）。分泌期Beclin1表達腺肌病組與對照組間有顯著性差異（P＜0.01）。腺肌病組HIF-1α表達增殖期與分泌期之間無

7、顯著性差異，對照組HIF-1α表達增殖期與分泌期之間有顯著性差異（P＜0.01）。增殖期HIF-1α表達腺肌病組顯著高于對照組（P＜0.01）。分泌期HIF-1α表達腺肌病組與對照組間無顯著性差異。腺肌病病灶組Beclin1表達顯著低于腺肌病增殖期組、腺肌病分泌期組、對照增殖期組及對照分泌期組（P＜0.01）。腺肌病病灶組Beclin1表達顯著低于HIF-1α表達（P＜0.01）。腺肌病病灶組HIF-1α表達顯著高于對照增殖期組（P＜0

8、.01），與腺肌病增殖期組、腺肌病分泌期組及對照分泌期組之間均無顯著性差異。3.Beelin1表達水平與血清CA125水平呈負相關(guān)關(guān)（n=140，r2=0.232，P=0.000），與盆腔疼痛（VAS評分）亦呈負相關(guān)（n=140，r2=0.508，P=0.000)。4.HIF-1a表達水平與血清CA125水平呈正相關(guān)（n=140，r2=0.268，P=0.000）。HIF-1α表達水平與盆腔疼痛（VAS評分）亦呈正相關(guān)(n=140，r2

9、=0.574，P=0.000)。5.Beclin1表達水平與HIF-1α表達水平呈負相關(guān)（n=140，r2=0.201，P=0.000)。
　　 第三部分 Beclin1在子宮腺肌病在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞中的表達及缺氧對其的影響
　　 目的：探討B(tài)eclin1在子宮腺肌病子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的表達及缺氧對其的影響，并對缺氧培養(yǎng)24小時后Beclin1表達水平與其增殖、遷移能力進行相關(guān)性分析。
　　 方法：對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞

10、進行原代培養(yǎng)并進行缺氧24小時處理，通過RT-PCR、蛋白免疫印跡技術(shù)、MTT及細胞遷移實驗觀察其增殖、遷移能力變化以及Beclin1表達變化。
　　 結(jié)果：1.通過灰度分析，子宮腺肌病組Beclin1 mRNA相對表達量為（0.72±0.19），明顯低于對照組（1.17±0.44）（P＜0.05）。子宮腺肌病組Beclin1蛋白相對表達量為（0.20±0.03），明顯低于對照組（0.71±0.12）（P＜0.01）。2.MTT

11、比色法發(fā)現(xiàn)，腺肌病常氧培養(yǎng)組OD值為（0.33±0.03），明顯高于對照常氧培養(yǎng)組（0.24±0.04）（P＜0.01），腺肌病缺氧培養(yǎng)組OD值為（0.46±0.03），明顯高于腺肌病常氧培養(yǎng)組（0.33±0.03）（P＜0.01），對照缺氧培養(yǎng)組OD值為（0.20±0.02），明顯低于對照常氧培養(yǎng)組（0.24±0.04）（P＜0.05）。3.細胞遷移實驗發(fā)現(xiàn)，腺肌病常氧培養(yǎng)組細胞遷移距離為（0.31±O.02mm），明顯高于對照常氧培

12、養(yǎng)組（0.28±0.02mm）（P＜0.01），腺肌病缺氧培養(yǎng)組細胞遷移距離為（0.37±0.02mm），明顯高于腺肌病常氧培養(yǎng)組（0.31±0.02mm）（P＜0.01），對照缺氧培養(yǎng)組細胞遷移距離為（0.14±0.02mm），明顯低于對照常氧培養(yǎng)組（0.28±0.02mm）（P＜0.01）。4.腺肌病缺氧組Beclin1蛋白相對表達量為（0.30±0.01），明顯低于腺肌病常氧組（0.49±0.01）（P＜O.01）。腺肌病缺氧組B

13、eclin1蛋白相對表達量為（0.30±0.01），明顯低于對照缺氧組（0.65±0.02）（P＜0.01）。對照缺氧組Beclin1蛋白相對表達量為（0.65±0.02）與對照常氧組（0.70±0.03）之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。腺肌病常氧組Beclin1蛋白相對表達量為（0.49±0.01），明顯低于對照常氧組（0.70±0.03）（P＜O.01）。5.通過Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，腺肌病在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞缺氧培養(yǎng)24小時后

14、Beclin1蛋白表達水平與MTT所測的OD值，遷移距離呈明顯的負相關(guān)關(guān)系(r2=0.564，0.469;P=0.004，0.042)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Beclin1蛋白定位于子宮內(nèi)膜腺細胞和間質(zhì)細胞。子宮腺肌病在位內(nèi)膜和病灶Beclin1表達均下調(diào)，Beclin1蛋白表達與血清CA125水平和盆腔疼痛呈負相關(guān)。Beclin1可能在子宮腺肌病的發(fā)病和進展中發(fā)揮作用。
　　 2.HIF-1α蛋白定位于子宮

15、內(nèi)膜腺細胞和間質(zhì)細胞，病灶以腺上皮表達為主。子宮腺肌病在位內(nèi)膜和病灶HIF-1α表達均上調(diào)，HIF-1α表達水平與血清CA125水平及盆腔疼痛呈正相關(guān)。HIF-1α可能在子宮腺肌病的發(fā)病和進展中發(fā)揮作用。
　　 3.Beclin1表達水平與HIF-1α表達水平呈負相關(guān)。HIF-1α表達越高、Beclin1表達越低，可能預(yù)示著子宮腺肌病病情越嚴(yán)重。
　　 4.腺肌病在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖和遷移能力明顯高于正常對照組。腺肌病在

16、位內(nèi)膜間質(zhì)細胞缺氧培養(yǎng)24小時后增殖和遷移能力明顯高于腺肌病常氧培養(yǎng)組。對照組在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞缺氧培養(yǎng)24小時后增殖和遷移能力明顯低于對照常氧培養(yǎng)組。缺氧使腺肌癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞擁有更強的增殖和遷移能力。
　　 5.腺肌病在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞缺氧培養(yǎng)24小時后Beclin1蛋白表達明顯低于腺肌病常氧培養(yǎng)組。對照缺氧組Beclin1蛋白表達與對照常氧組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 6.腺肌病在位內(nèi)膜間質(zhì)細胞缺氧培養(yǎng)24小時后Bec