HIF-1α-BNIP3-Beclin-1信號通路介導(dǎo)的自噬與孕期缺氧胎鼠腎發(fā)育障礙的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:高血壓和腎疾病的發(fā)病率及死亡率日益增加,嚴(yán)重威脅人類健康。長期以來,認(rèn)為遺傳和生活方式在其發(fā)病中起重要作用。近年來,大量的流行病學(xué)研究表明宮內(nèi)不良環(huán)境造成胎兒的發(fā)育程序化,導(dǎo)致其發(fā)生高血壓和腎臟疾病的風(fēng)險增加。出生體重低于2500克的嬰兒均稱為低出生體重(Low Birth Weight,LBW)兒,通常由早產(chǎn)(Preterm Birth,PB)或?qū)m內(nèi)生長遲緩(Intrauterine Growth Retardation,I

2、UGR)所導(dǎo)致。據(jù)統(tǒng)計,LBW發(fā)生率約為7-15％。1989年David Barker教授首次提出心血管疾病與出生體重有關(guān),進(jìn)而發(fā)展成胚胎編程學(xué)說:低出生體重(Low Birth Weight,LBW)是心血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險因素之一,對成年期的腎臟疾病和高血壓可產(chǎn)生不同的影響。PB或IUGR導(dǎo)致的LBW伴發(fā)腎及腎單位發(fā)育不良,是日后腎疾病發(fā)生的危險因素。充足的氧供對胎兒的生長發(fā)育是必需的,缺氧會影響胎兒發(fā)育。孕期缺氧是胚胎發(fā)育中的常

3、見現(xiàn)象,妊娠期母體的多種生理因素或病理因素誘發(fā)孕婦缺氧。研究表明胎兒孕期缺氧不僅會引起胎兒宮內(nèi)生長受限,造成胎兒LBW,還會造成胎兒重要組織器官譬如腎的發(fā)育不良。孕期缺氧對胎兒腎發(fā)育造成怎樣的病理改變,目前國內(nèi)外報道甚少。大量研究顯示:成熟腎臟在病理狀態(tài)下高表達(dá)的分子,在腎臟發(fā)育過程中也高表達(dá),而且細(xì)胞表型的改變類似于胚胎腎發(fā)育過程中后腎間充質(zhì)細(xì)胞向上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的逆過程。這些研究結(jié)果提示腎臟損傷后細(xì)胞的再生過程和腎臟胚胎發(fā)育過程有著極

4、其密切的關(guān)系,因此,對腎發(fā)育的研究有助于理解后天性腎臟疾病發(fā)生的病理生理機(jī)制。自噬和凋亡在胚胎、器官的發(fā)育以及組織分化過程中起重要作用。自噬,又名Ⅱ型細(xì)胞程序性死亡,是一個自體吞噬的過程,即:亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)的形態(tài)學(xué)改變,并通過溶酶體介導(dǎo)蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的過程,主要包括4個環(huán)節(jié):底物誘導(dǎo)自噬前體(proautophagosome,PAS)的形成、自噬體(autophagosome)形成、自噬體與溶酶體融合和自噬體內(nèi)容物被降解。LB

5、W患者腎及腎單位發(fā)育落后的機(jī)制還不完全清楚。研究表明I型細(xì)胞程序性死亡即凋亡是LBW患者腎及腎單位發(fā)育落后的原因之一。自噬是否也參與了這一過程國內(nèi)外尚未有報道。自噬激活過程,往往與凋亡共存或同時發(fā)生。一個突破性的研究表明凋亡抑制分子BCL-2可以通過與自噬的標(biāo)記物之一Beclin-1相互作用,進(jìn)而對自噬發(fā)揮作用。自噬在孕期缺氧大鼠腎單位發(fā)育的作用及其機(jī)制目前國內(nèi)外都未見報道。因此,進(jìn)一步論證自噬與腎單位發(fā)育的關(guān)系,深入分析其分子調(diào)控機(jī)制

6、就顯得十分必要。PI3K/Akt/mTOR和HIF-1α/BNIP3/Beclin-1是細(xì)胞低氧條件下發(fā)生自噬上調(diào)的二條重要信號通路。本課題對此二條信號通路是否參與了孕期缺氧誘導(dǎo)的腎發(fā)育障礙的腎細(xì)胞的損傷進(jìn)行初步的研究。為探討孕期缺氧對胎鼠腎臟發(fā)育落后的機(jī)制,本實驗利用大鼠及大鼠腎細(xì)胞株(NRK-52E),分別從整體、組織器官、細(xì)胞、分子水平,就孕期缺氧誘導(dǎo)的自噬對胎鼠腎臟發(fā)育的影響及自噬信號通路進(jìn)行了研究。本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。

7、
　　第一部分 孕期缺氧對胎鼠形態(tài)學(xué)、血?dú)饧澳I臟發(fā)育和功能的影響
　　目的:觀察孕期缺氧對胎鼠形態(tài)學(xué)的影響,以及對腎臟發(fā)育和功能的影響。
　　方法:孕鼠從妊娠第4天至第21天(Gestation Day,GD4-21)置缺氧箱(常壓低氧,O2濃度為10.5％),建立LBW動物模型。缺氧期間每天稱量孕鼠飲食量及體重,計算體重增長量。于GD21天,以剖宮術(shù)取胎鼠。以正常胎鼠做對照,測量胎鼠(GD21)的身長、尾長,稱量胎鼠

8、體重、臟器如心、肝、肺、腎和腦等重量;用血?dú)夥治鰞x檢測胎鼠血?dú)庵笜?biāo);用酶標(biāo)法分析胎鼠血液中尿酸(Uric Acid,UA)、血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)、肌酐(Creatinine,CRE)含量;分別對上述樣本腎臟組織進(jìn)行 HE染色,光鏡觀察組織結(jié)構(gòu);電鏡觀察胎鼠腎臟的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:與對照組相比,孕期缺氧對孕鼠飲食量有一過性影響、對體重增長量無明顯影響,但可顯著降低胎鼠的體重、腎量、心重、肝重

9、、肺重及腎重指數(shù)、肝重指數(shù);明顯降低胎鼠血液中pO2、SO2％水平。組織形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示孕期缺氧可使胎鼠腎間質(zhì)增生、腎囊腔增寬、腎小球固縮;足細(xì)胞足突分支減少且變低平,線粒體腫脹變形,嵴固縮。
　　結(jié)論:孕期缺氧導(dǎo)致胎鼠及腎臟發(fā)育落后。
　　第二部分 孕期缺氧誘導(dǎo)IUGR胎鼠腎臟自噬及凋亡的機(jī)制研究
　　目的:探討孕期缺氧對胎鼠腎臟自噬及凋亡程度的影響;研究孕期缺氧調(diào)控自噬及凋亡的信號通路。分析凋亡及自噬與孕期缺氧誘導(dǎo)的

10、腎發(fā)育障礙的相關(guān)聯(lián)系。
　　方法:用放免法檢測IUGR胎鼠腎臟組織中可溶性抗凋亡蛋白及自噬相關(guān)蛋白;用透射電鏡法觀察實質(zhì)細(xì)胞中自噬結(jié)構(gòu)的改變;用免疫印跡法檢測腎臟組織中凋亡相關(guān)蛋白、自噬標(biāo)記蛋白以及自噬通路、凋亡通路關(guān)鍵蛋白;采用real-time PCR法檢測缺氧后腎臟組織LC3 mRNA的表達(dá)水平。TUNEL染色法檢測腎臟細(xì)胞發(fā)生凋亡的程度。
　　結(jié)果:孕期缺氧可導(dǎo)致胎鼠腎臟組織APG5L含量增加,而sFAS無顯著變化。

11、孕期缺氧可使腎細(xì)胞中自噬小體及自噬溶酶體等自噬結(jié)構(gòu)顯著增加,自噬活性增加。與對照組相比,缺氧組自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)明顯增加,而LC3-I表達(dá)無明顯變化,LC3-II/LC3-I顯著增高;p62及BCL-2蛋白表達(dá)明顯減少。缺氧胎鼠腎臟中的自噬通路關(guān)鍵蛋白Beclin-1, p-S6, HIF-1α表達(dá)增加,而AKT及p-AKT含量減少。TUNEL染色陽性細(xì)胞缺氧組明顯多于對照組。
　　結(jié)論:孕期缺氧引起胎鼠腎臟組織中自噬上

12、調(diào)及自噬活性增加。激活自噬的機(jī)制可能是HIF-1α/BNIP3/Beclin-1通路的激活,而與PI3K/Akt/mTOR通路關(guān)系不大。細(xì)胞凋亡增加的可能機(jī)制是抑制BCL-2信號通路而激活了caspase-3信號途徑,與sFas/FasL信號受體途徑無關(guān)。
　　第三部分 低氧對NRK-52E細(xì)胞自噬的影響
　　目的:觀察低氧對NRK-52E細(xì)胞的生長以及自噬程度的影響;探討自噬在低氧環(huán)境下對細(xì)胞存亡的影響。
　　方法:

13、首先常規(guī)培養(yǎng)NRK-52E細(xì)胞,通過倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及細(xì)胞計數(shù),繪制生長曲線圖,探索NRK-52E細(xì)胞的增殖期,明確NRK-52E細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)的最佳時間;通過western-blot法檢測不同濃度3-MA干預(yù)后對自噬標(biāo)記蛋白表達(dá)水平影響程度,確定藥物干預(yù)的最適藥物濃度。在最適時機(jī)用最佳3-MA藥物濃度干預(yù)后,用免疫印跡法檢測LC3、Beclin1及p62的蛋白表達(dá)水平,推測低氧對細(xì)胞自噬及其活性的影響;通過MTT法及LDH法

14、分別檢測細(xì)胞存活率及乳酸脫氫酶漏出率的檢測,分析低氧誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞存亡的影響。通過使用三氣培養(yǎng)箱的使用建立NRK-52E細(xì)胞缺氧模型,應(yīng)用自噬抑制劑,檢測自噬表達(dá)被抑制時NRK-52E細(xì)胞的生長情況;分析在低氧環(huán)境中自噬對NRK-52E細(xì)胞的存活的作用。
　　結(jié)果:在24小時內(nèi)細(xì)胞呈指數(shù)形式生長,24小時后進(jìn)入生長平臺期,獲得了低氧干預(yù)的最佳時間;低氧環(huán)境使NRK-52E細(xì)胞增殖速度減慢,細(xì)胞存活率下降而死亡率上升;同時細(xì)胞死亡