DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅱα對腫瘤干細(xì)胞在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖機(jī)制中作用的研究.pdf

1、目的：
　　 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(gdio blastoma multiforme,GBM)是最常見的惡性程度最高的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤,雖采用各種手段綜合治療,但療效仍不理想。腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcells,CSCs)是指存在于腫瘤當(dāng)中具有干細(xì)胞特性的一組細(xì)胞集群,在腫瘤發(fā)生增殖過程中起關(guān)鍵作用。本研究擬在已成功分離鑒定GBM的CSCs及對增殖相關(guān)因子DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶-Ⅱα(Topoisomerase-Ⅱα,Topo-Ⅱ

2、α)與GBM增殖關(guān)系研究的前期工作基礎(chǔ)上,分離GBM的CSCs與非腫瘤干細(xì)胞(non-cancerstemcells,non-CSCs)兩種細(xì)胞,進(jìn)行體外培養(yǎng);應(yīng)用Westernblot及Real-timePCR等分子生物學(xué)手段研究Topo-Ⅱα的表達(dá)差異;應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默Topo-Ⅱα的表達(dá),研究Topo-Ⅱα對CSCs增殖、凋亡等生物學(xué)特性的影響;進(jìn)一步應(yīng)用Topo-Ⅱα抑制劑進(jìn)行干預(yù),研究細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路的變化

3、,明確Topo-Ⅱα及其抑制劑對CSCs在腫瘤增殖過程中作用的影響及機(jī)制。本項(xiàng)研究不僅能在分子水平上闡明GBM的發(fā)病機(jī)理,還將為GBM的治療提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 選購人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞系模型進(jìn)行體外培養(yǎng),應(yīng)用含生長因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)約1-2周,分離和鑒定其中的CSCs及non-CSCs;應(yīng)用Westernblot及Real-timePCR法檢測CSCs及non-CSCs中Topo

4、-Ⅱα的表達(dá)差異;設(shè)計并合成了Topo-Ⅱα基因特異性的siRNA并轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞的CSCs,檢測Topo-Ⅱα表達(dá)沉默對CSCs的增殖能力、凋亡情況和細(xì)胞周期等生物學(xué)性狀的影響,進(jìn)一步了解Topo-Ⅱα在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生機(jī)制中的作用。
　　 應(yīng)用不同類型的Topo-Ⅱα抑制劑HU-331及阿霉素(doxorubicin,Dox)干預(yù)U87MG細(xì)胞的CSCs及non-CSCs生長,應(yīng)用MTT法及流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞增殖情況和細(xì)胞凋

5、亡情況;進(jìn)一步應(yīng)用Westernblot法檢測Topo-Ⅱα抑制劑對CSCs增殖及細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)通路相關(guān)因子(p38MAPK及caspase-3)表達(dá)的影響,明確Topo-Ⅱα及其抑制劑對CSCs在腫瘤增殖過程中的作用及影響機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1、人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG細(xì)胞系的培養(yǎng)及CSCs的分離與鑒定
　　 體外培養(yǎng)U87MG細(xì)胞系,并應(yīng)用含有生長因子(EGF,bFGF)的無血清干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)1

6、-2周,成功分離出細(xì)胞球細(xì)胞(neurospherecells,NCs),進(jìn)一步通過CD133染色證實(shí)NCs陽性染色率明顯高于非細(xì)胞球細(xì)胞(non-sphereformingcells,NSFCs);將NCs打散進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化證實(shí)其具有多向分化能力;從而證實(shí)了NCs具有能分化成GBM并使之呈現(xiàn)細(xì)胞多樣性的特點(diǎn),具備CSCs的特性。
　　 2、Topo-Ⅱα在CSCs和non-CSCs中的表達(dá)
　　 應(yīng)用Real

7、-timePCR和Westernblot法驗(yàn)證Topo-Ⅱα在CSCs中的表達(dá)較non-CSCs中顯著升高(P＜0.05)。
　　 3、特異性siRNA合成及轉(zhuǎn)染
　　 成功地設(shè)計并合成了Topo-Ⅱα基因特異性的siRNA并轉(zhuǎn)染CSCs,通過Real-timePCR和Westernblot驗(yàn)證得到了Topo-Ⅱα基因低表達(dá)的CSCs模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染siRNA-Topo-Ⅱα的細(xì)胞增殖能力顯著降低(P＜0.05),細(xì)胞

8、明顯阻滯于G0/G1期,細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)。
　　 4、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox對CSCs及non-CSCs增殖的影響
　　 應(yīng)用Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox分別干預(yù)CSCs及non-CSCs,觀察細(xì)胞的生長增殖情況,發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞都出現(xiàn)了生長停滯且細(xì)胞死亡的現(xiàn)象,但經(jīng)MTT法驗(yàn)證CSCs組細(xì)胞增殖能力較non-CSCs組顯著降低(P＜0.05);HU-331對CSCs和non-

9、CSCs的作用強(qiáng)于Dox的作用,HU-331和Dox抑制CSCs增殖的作用強(qiáng)于對non-CSCs的作用。
　　 5、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox對CSCs及non-CSCs凋亡的影響
　　 應(yīng)用AnnexinV和PI雙標(biāo)法通過流式細(xì)胞儀分析Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox干預(yù)后的CSCs及non-CSCs的凋亡情況,并應(yīng)用Westernblot法檢測細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HU-33

10、1和Dox顯著增加了CSCs和non-CSCs的凋亡率(P＜0.05)并顯著上調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)(P＜0.05),HU-331的促凋亡作用強(qiáng)于Dox的作用;且HU-331和Dox促進(jìn)CSCs凋亡的作用強(qiáng)于對non-CSCs的作用。
　　 6、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox對CSCs及non-CSCs中p-p38蛋白表達(dá)的影響
　　 應(yīng)用Westernblot法檢測Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和D

11、ox干預(yù)后的CSCs及non-CSCs中p-p38蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HU-331和Dox顯著上調(diào)了p-p38蛋白的表達(dá)(P＜0.05),HU-331上調(diào)p-p38蛋白表達(dá)的作用強(qiáng)于Dox的作用;且HU-331和Dox對CSCs的作用強(qiáng)于對non-CSCs的作用。
　　 7、p38抑制劑SB203580與Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox聯(lián)合應(yīng)用對CSCs凋亡的影響
　　 Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox單獨(dú)以

12、及分別與p38抑制劑SB203580聯(lián)合作用于CSCs,應(yīng)用Westernblot法檢測細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3的表達(dá),并應(yīng)用AnnexinV和PI雙標(biāo)法通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況,發(fā)現(xiàn)p38抑制劑SB203580能夠顯著下調(diào)caspase-3蛋白的表達(dá)和細(xì)胞凋亡率(P＜0.05),說明p38抑制劑SB203580顯著抑制了HU-331和Dox對CSCs的促凋亡效應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1、從人腦膠質(zhì)母細(xì)胞

13、瘤U87細(xì)胞系中分離出NCs,并經(jīng)CD133特異性染色及細(xì)胞多向分化能力鑒定其具備CSCs特性。
　　 2、Topo-Ⅱα在CSCs中的表達(dá)顯著高于在non-CSCs中的表達(dá)。
　　 3、設(shè)計并合成的特異性siRNA-Topo-Ⅱα,成功轉(zhuǎn)染至U87MG細(xì)胞系CSCs,獲得了Topo-Ⅱα基因低表達(dá)的CSCs模型。
　　 4、RNA干擾Topo-Ⅱα降低CSCs的細(xì)胞增殖能力,影響細(xì)胞周期變化發(fā)揮促凋亡作用。

14、r>　　 5、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox能夠顯著抑制CSCs和non-CSCs的增殖并促進(jìn)其凋亡,且HU-331的作用強(qiáng)于Dox的作用;HU-331和Dox對CSCs的作用強(qiáng)于對non-CSCs的作用。
　　 6、Topo-Ⅱα抑制劑HU-331和Dox均能夠通過p38MAPK介導(dǎo)的凋亡分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響膠質(zhì)瘤CSCs及non-CSCs的凋亡,且HU-331的作用強(qiáng)于Dox的作用。P38抑制劑SB203580顯