2-苯基萘靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶抗腫瘤作用機(jī)制研究.pdf

1、拓?fù)洚悩?gòu)酶是真核生物體內(nèi)最重要的酶之一，調(diào)節(jié)DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、染色體重組以及姐妹染色體分離等多個環(huán)節(jié)。拓?fù)洚悩?gòu)酶已經(jīng)成為抗腫瘤藥物的一個重要靶點(diǎn)，靶向拓?fù)洚悩?gòu)酶的藥物在臨床上也取得了很好的療效。但拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑在臨床使用過程中出現(xiàn)了許多毒副作用，除了常見的胃腸道反應(yīng)，皮膚病，還有許多嚴(yán)重的不良反應(yīng)如阿霉素引起的嚴(yán)重新心臟毒性、依托泊苷誘發(fā)次生腫瘤（白血?。┮约岸嗨幠退幍?。多年來，開發(fā)高效低毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑一直是

2、抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一。
　　天然三聯(lián)苯類化合物主要來源于真菌代謝產(chǎn)物，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的三聯(lián)苯類化合物表現(xiàn)出多種生物活性包括抗腫瘤，抗氧化，抗細(xì)菌等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)對三聯(lián)苯H1-H8抑制人乳腺導(dǎo)管癌MDA-MB-435細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞G2/M期停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，H1-H8以及從鏈霉菌sp.LZ35中分離得到的對三聯(lián)苯echosidesA-E能不同程度地抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，但是這類化合物在對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的選擇性以

3、及體內(nèi)抗腫瘤活性較差?；谇捌诘难芯炕A(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)室以對三聯(lián)苯為基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造針對拓?fù)洚悩?gòu)酶設(shè)計合成了一系列2-苯基萘，本論文研究這一系列2-苯基萘的抗腫瘤活性及其對拓?fù)洚悩?gòu)酶的抑制活性，并挑選代表化合物CS1深入研究這類化合物的體內(nèi)外抗腫瘤活性及其抗腫瘤作用機(jī)制。
　　我們首先用SRB法檢測了48個2-苯基萘對三株腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231，A549和HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果有11個化合物對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞

4、的IC50小于5μM。然后我們用DNA松弛實(shí)驗(yàn)檢測這11個細(xì)胞毒性較強(qiáng)的化合物對拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的抑制作用，有5個化合物能完全抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性。我們挑選代表化合物1(CS1)深入研究其抗腫瘤作用機(jī)制。為研究CS1體外抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用方式，我們采用了pBR322DNA松弛實(shí)驗(yàn)、kDNA解除鏈接實(shí)驗(yàn)、DNA嵌入實(shí)驗(yàn)以及拓?fù)洚悩?gòu)酶介導(dǎo)的DNA斷裂檢測實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CS1是一個DNA非嵌入劑，能夠穩(wěn)定拓?fù)洚悩?gòu)酶-DNA可切割

5、三元復(fù)合物，作為一個拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ毒劑抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性。為全面評價CS1的體外抗腫瘤作用，我們選取不同組織來源的十一株細(xì)胞檢測其細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示CS1對多種組織來源的腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的細(xì)胞毒性，但對正常細(xì)胞株HUVEC和HL7702細(xì)胞毒性較小。同時我們還檢測了CS1對p-糖蛋白過表達(dá)的多藥耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR的細(xì)胞毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CS1對敏感細(xì)胞MCF-7和耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR表現(xiàn)出相同程度的細(xì)胞毒性，并且CS1不

6、引起TopoⅡα和TopoⅡβ蛋白降解，這表明CS1具有潛在抗多藥耐藥作用且不易引起耐藥性。周期分析和DNALadder實(shí)驗(yàn)顯示CS1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，我們進(jìn)一步用AnneixnV/PI雙染色證明CS1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有一定濃度依賴性。彗星電泳，免疫熒光和免疫印跡等實(shí)驗(yàn)顯示CS1能夠引起DNA斷裂，有趣的是CS1并沒有激活典型的ATM-Chk1/Chk2應(yīng)激反應(yīng)，只選擇性磷酸化DNA損傷信號蛋白ATR但對ATM沒有影響。Hoechst3334

7、2染色顯示，CS1誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多核現(xiàn)象，我們進(jìn)一步用免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)CS1誘導(dǎo)細(xì)胞不正常有絲分裂，形成多個極點(diǎn)，細(xì)胞不對稱分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生有絲分裂災(zāi)難。最后，我們還有檢測了CS1在裸鼠體內(nèi)對MDA-MB-231腫瘤的抑制作用，結(jié)果顯示CS1給藥15天能顯著抑制腫瘤的生長，按瘤重計算抑制率達(dá)62.3％，按腫瘤體積計算抑制率達(dá)43.6％，并且CS1對裸鼠體重沒有任何影響。
　　綜上所述，以CS1為代表的2-苯基萘類化合物具有很強(qiáng)的抗