抗腫瘤藥物4-羥苯基維胺脂低氧耐藥作用機制研究.pdf

1、研究目的:4-羥苯基維胺脂(4-HPR;Fenretinide;N-4-hydroxyphenylretinamide)是一個維甲酸衍生物,在多種腫瘤模型中表現出良好的腫瘤預防和治療作用。研究表明4-HPR主要通過誘導細胞發(fā)生凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。然而在臨床前及臨床研究的低氧環(huán)境下,腫瘤細胞對4-HPR產生耐藥現象,影響了4-HPR的臨床應用。低氧是實體腫瘤中普遍具有的特性之一,在多種生理過程(細胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲等)中發(fā)揮重要作

2、用,可以激活各種信號通路導致腫瘤細胞對放化療的耐藥。文獻提示4-HPR在較低濃度下可能會誘發(fā)自噬的產生。在不利于細胞生存的代謝壓力下,自噬可以通過降解自身的細胞質和細胞器,在細胞內維持穩(wěn)態(tài)平衡以保護細胞免于發(fā)生凋亡性死亡,因此我們推測保護性自噬與4.HPR的低氧耐藥相關.本課題針對自噬在4-HPR低氧耐藥過程中所發(fā)揮的作用開展研究工作,并對相關機制加以探索。
　　 研究方法:采用磺基羅丹明B(SRB)染色法評價4-HPR體外抑制

3、腫瘤細胞HeLa增殖作用,并分別計算正常氧壓(20％O2)和低氧(1%O2)下IC50值;采用PI單染結合流式細胞術,考察4-HPR正常氧壓和低氧下促腫瘤細胞凋亡的能力;應用Westernblot檢測細胞凋亡及自噬標志性蛋白(PARP、LC3)及低氧誘導因子HIF-1α的表達,并對相關蛋白條帶進行光密度分析;采用吖啶橙染色,在倒置熒光顯微鏡下定性觀察酸性囊泡(AVOs)生成,流式細胞術定量分析紅色熒光強度;采用瞬時RNA干擾技術,通過沉

4、默自噬相關基因Beclin1,考察其在4-HPR引起的自噬中的作用;預孵育抗氧化劑NAC,檢測活性氧簇(ROS)對自噬的影響;采用RNA干擾技術沉默HIF-1α,建立穩(wěn)定敲除HIF-1α的細胞株,檢測HIF-1α對于4-HPR誘導發(fā)生自噬的作用。
　　 研究結果:
　　 1.低氧下腫瘤細胞對于4-HPR耐藥
　　 正常氧壓下4-HPR作用人官頸癌Hela細胞的存活率顯著低于低氧下存活率,并呈濃度依賴性。正常氧壓下

5、,10μM的4-HPR能引起Hela細胞明顯的凋亡,凋亡率達到25.80%。低氧環(huán)境中細胞在相同濃度4-HPR作用下,凋亡率僅有7.69%。正常氧壓下4-HPR對Hela細胞的半數抑制濃度(IC50)為(6.69±1.49)μM,而在低氧下則為(15.69±3.56)μM。
　　 2.4-HPR在低氧下主要引起自噬,而在正常氧壓下引起凋亡
　　 采用Hela細胞和人卵巢癌OVCAR-8細胞,分別檢測低氧和正常氧壓下4-H

6、PR作用后凋亡和自噬相關蛋白表達,發(fā)現低氧下LC3-Ⅱ蛋白表達的增加呈現濃度依賴性,正常氧壓下沒有明顯的LC3-Ⅱ蛋白表達的累積,凋亡標志蛋白PARP有明顯切割。
　　 4-HPR(10μM)作用人宮頸癌Hela細胞24h,吖啶橙染色后,使用流式細胞儀(BectonDickinson)進行分析,結果發(fā)現,4-HPR(10μM)作用后,紅色熒光強度從3.45%升高到19.36%,表明4-HPR低氧下可以誘導自噬發(fā)生。而在使用自噬抑

7、制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)預孵育后加入4-HPR作用的實驗組,紅色熒光強度僅為7.02%,表明白噬的發(fā)生被抑制。4-HPR.(20μM)作用于人卵巢癌OVCAR-8細胞24h,吖啶橙染色后,在熒光顯微鏡下觀察到酸性囊泡數目的增加,而在使用自噬抑制劑3-MA預孵育后加入4-HPR作用的實驗組,酸性囊泡的增加受到了抑制,說明3-MA可以抑制由4-HPR誘導的自噬發(fā)生。
　　 3.低氧下4-HPR誘導的腫瘤細胞自噬對細胞產生保護作

8、用
　　 在Hela細胞上,將自噬抑制劑3-MA和氯喹(CQ)分別與4-HPR聯用,結果發(fā)現CQ/4-HPR或3-MA/4-HPR合用,PARP的切割較4-HPR單用有明顯的增加。應用流式細胞術,檢測4-HPR在正常氧壓和低氧下引起的細胞凋亡率。4-HPR單用凋亡率為6.64±0.79%,3-MA單用凋亡率為4.00±0.07%,CQ單用凋亡率為4.95±0.60%,而3-MA/4-HPR合用凋亡率為16.06±0.23%,CQ

9、/4-HPR合用凋亡率為21.39±0.32%,顯示了自噬的抑制會導致4-HPR介導的HeLa細胞凋亡率的增加。正常氧壓下3-MA和CQ不能增加4-HPR誘導凋亡的能力,進一步確證正常氧壓下4-HPR主要引起凋亡而非自噬。應用SRB檢測低氧下自噬被抑制后4-HPR的細胞存活率的變化,發(fā)現低氧下,3-MA顯著地增強了4-HPR對細胞的增殖抑制作用,10μM4-HPR單用24h的HeLa細胞增殖抑制率為41.24±5.61%,2mM3-MA

10、與10μM4-HPR合用的細胞增殖抑制率為55.97±4.67%(p＜0.05)。
　　 4.Beclin1蛋白參與了4-HPR誘導的自噬
　　 Beclin1蛋白是自噬體形成過程中所必需的促自噬基因的產物,參與了自噬的起始階段,在HeLa細胞中沉默Beclin1基因顯著地抑制了低氧4-HPR誘導的自噬。這個結果顯示,低氧下4-HPR誘導自噬的發(fā)生需要Beclin1蛋白的參與。在HeLa細胞中外源性轉入Beclin1導致

11、Beclin1蛋白水平的提高時,4-HPR在正常氧壓條件下也能明顯誘導自噬發(fā)生,進一步說明Beclin1蛋白參與了4-HPR誘導的自噬。
　　 5.低氧下4-HPR誘導自噬不依賴于活性氧簇
　　 正常氧壓下活性氧簇(ROS)清除劑NAC能顯著減少4-HPR引起的PARP切割,說明4-HPR誘導的凋亡被NAC成功逆轉,提示正常氧壓下4-HPR凋亡誘導作用的發(fā)揮依賴于ROS。低氧下NAC并不能抑制LC3-Ⅱ蛋白表達的累積,說

12、明低氧下4-HPR誘導自噬是不依賴于ROS的。
　　 6.HIF-1α介導了低氧下4-HPR誘發(fā)的自噬
　　 與Hela細胞相比,穩(wěn)定敲除HIF-1α基因的Hela細胞對4-HPR(24h)的敏感性明顯增加,4-HPR(10μM)作用下,Hela細胞的存活率為58.76±5.61%,穩(wěn)定敲除HIF-1α基因的Hela細胞存活率為27.26±6.61%(p＜0.01)。在穩(wěn)定敲除HIF-1α基因的Hela細胞中,4-HPR

13、(10μM)能導致明顯的PARP切割片段的產生,卻不能誘導自噬的產生,說明HIF-1α蛋白的表達對于4-HPR誘發(fā)的自噬是必要的。
　　 結論:本論文較為系統(tǒng)的研究了在低氧情況下,4-HPR作用于人官頸癌Hela細胞和人卵巢癌OVCAR-8細胞過程中自噬發(fā)揮的作用,并對相關機制加以探索。研究發(fā)現,4-HPR可以誘導保護性自噬發(fā)生,這種保護性自噬由HIF-1α介導,依賴于Beclin1的存在,但不通過活性氧簇(ROS)介導。穩(wěn)定敲