冬凌草甲素通過增強細(xì)胞自噬活性提高NVP-BEZ235對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤效應(yīng).pdf

1、研究背景和目的:
　　PI3K/Akt/mTOR信號通路在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中存在異常激活，并與預(yù)后密切相關(guān)；然而，NVP-BEZ235作為新型PI3K/mTOR雙靶點抑制劑，單獨應(yīng)用并不能有效誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。為增強 NVP-BEZ235的抗腫瘤效應(yīng)，充分發(fā)揮其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療中的潛在應(yīng)用價值，有必要探索以 NVP-BEZ235為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案。冬凌草甲素（Oridonin，ORI）是從中草藥冬凌草中提取出來的貝殼杉烯二

2、萜類天然化合物，可以作為一種輔助藥物顯著增強吉西他濱和伊馬替尼等多種化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)。本研究采用冬凌草甲素與 NVP-BEZ235聯(lián)合方案處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞并構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，觀察該聯(lián)合方案在體內(nèi)外水平對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤效應(yīng)，并探討其可能的分子機制。
　　研究方法:
　　1. CCK-8法和免疫印跡法分別檢測NVP-BEZ235對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響；流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡法進一步探討 NVP-BE

3、Z235抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的機制。
　　2. CCK-8、AO/EB雙熒光染色和免疫印跡法檢測冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用在體外水平對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響；Ki-67免疫組化和TUNEL實驗檢測冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)水平對神經(jīng)母細(xì)胞裸鼠移植瘤增殖和凋亡的影響。
　　3.免疫印跡法檢測冬凌草甲素與NVP-BEZ235單獨或聯(lián)合應(yīng)用對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬活性的影響。以pLKO

4、.1為載體，構(gòu)建針對自噬基因Beclin-1的shRNA干擾質(zhì)粒，利用293T細(xì)胞包裝生產(chǎn)病毒液，感染SHSY-5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，免疫印跡法驗證靶基因的沉默效果；AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用對Beclin-1基因敲減的SHSY-5Y細(xì)胞凋亡的影響，免疫印跡法進一步檢測冬凌草甲素與 NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用對 Beclin-1基因敲減的SHSY-5Y細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)

5、蛋白表達水平的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1. NVP-BEZ235可以顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，并且呈明顯的時間和劑量依賴性；但其并不能有效誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)顯示神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞經(jīng)NVP-BEZ235處理后G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著增多，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯減少；且G1期細(xì)胞周期素cyclinD1和cyclinE1表達減少。
　　2.冬凌草甲素和NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用可以更顯著地抑制神經(jīng)

6、母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，并有效誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡；冬凌草甲素和 NVP-BEZ235聯(lián)合用藥組裸鼠移植瘤體積和質(zhì)量相對于對照組和單藥處理組明顯減小，Ki-67陽性增殖細(xì)胞比例顯著降低，TUNEL陽性凋亡細(xì)胞比例明顯增多。
　　3.冬凌草甲素和NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡伴隨著細(xì)胞自噬活性的顯著增強；shRNA干擾自噬基因 Beclin-1表達后，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞整體自噬活性顯著降低，細(xì)胞經(jīng)冬凌草甲素和 NV

7、P-BEZ235聯(lián)合處理后凋亡細(xì)胞比率明顯減小，凋亡相關(guān)蛋白表達減少。
　　研究結(jié)論:
　　1. NVP-BEZ235單獨應(yīng)用可以通過G1期阻滯作用顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，但并不能誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。
　　2.冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用可以有效誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞和動物水平上對神經(jīng)母細(xì)胞瘤產(chǎn)生顯著的抗腫瘤效應(yīng)。
　　3.冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤