冬凌草甲素抗腫瘤細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機制的實驗性研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是常見惡性腫瘤，由于起病隱匿，早期沒有癥狀或癥狀不明顯但進展迅速，確診時大多數(shù)患者已經(jīng)達(dá)到局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療困難，預(yù)后很差，如果僅采取支持對癥治療，自然生存時間很短，嚴(yán)重地威脅人民群眾的身體健康和生命安全。目前的治療以手術(shù)、放化療、介入性治療、分子靶向藥物治療和中醫(yī)藥治療為主。冬凌草甲素（Oridonin，ORI）提取自傳統(tǒng)中藥冬凌草，臨床研究表明冬凌草甲素對食管癌

2、、賁門癌、原發(fā)性肝癌和乳腺癌等腫瘤具有一定的療效，延長患者生命。目前對冬凌草甲素抗腫瘤機制多集中于對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增強其他抗腫瘤藥物療效等方面。近年來的研究結(jié)果顯示冬凌草甲素還具有免疫調(diào)節(jié)作用，該分子在體內(nèi)抗腫瘤作用中，是否還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的功能，從而協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用值得深入研究。
　　為此，本研究將采用細(xì)胞學(xué)和實驗動物模型，深入探討水溶性冬凌草甲素對小鼠肝癌細(xì)胞系H22細(xì)胞的抗腫瘤作用及其相關(guān)

3、細(xì)胞免疫應(yīng)答機制。包括采用不同濃度的ORI作用于體外培養(yǎng)的H22細(xì)胞，用CCK-8法測定ORI對H22細(xì)胞增殖的抑制作用；用Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測H22細(xì)胞的凋亡率；利用C57BL/6J小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型，設(shè)立荷瘤對照組（PBS組）、ORI高、中、低劑量組（75、50、25mg/kg/天）、陽性對照組（5-Fu組）和空白對照組(NC組)，連續(xù)腹腔注射給藥12天后處死后，以瘤重、抑瘤率觀察ORI對移植瘤生

4、長的影響；常規(guī)HE染色，光鏡下觀察 H22肝癌組織病理學(xué)改變；采用乳酸脫氫酶（LDH)釋放法檢測不同組別荷瘤小鼠脾臟細(xì)胞對小鼠H22細(xì)胞殺傷活性；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測小鼠脾臟細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞分泌IL-17、IL-2、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子能力的影響，檢測CD8+T和 CD4+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)。并采用體外實驗，檢測小鼠脾臟細(xì)胞在抗小鼠抗CD3/CD28磁珠刺激條件下，測定不同濃度（4.0μg/ml和8.0μg/m

5、l）的ORI處理后小鼠脾臟細(xì)胞分泌IL-17、IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平和對小鼠H22細(xì)胞殺傷活性。
　　結(jié)果顯示，冬凌草甲素可在體外顯著抑制H22細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，呈明顯的量-效與時-效關(guān)系(P<0.01)；同時ORI的體內(nèi)抑制試驗結(jié)果顯示低、中、高劑量ORI處理組的抑瘤率分別為32.51％、40.02%、52.51%，與未處理荷瘤對照組相比均有不同程度的縮小(P<0.05)；ORI能明顯提高荷瘤小鼠脾臟

6、細(xì)胞對H22細(xì)胞的殺傷活性(P<0.05)，抑制CD4+T細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌，尤其對IL-17和IL-2的抑制最為明顯，對TNF-α和IFN-γ抑制在ORI高濃度情況下發(fā)揮作用；同時，ORI處理組中CD8+T細(xì)胞的PD-1表達(dá)降低，而CD4+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)呈現(xiàn)一定程度的上調(diào)。上述ORI對荷瘤小鼠淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用在體外實驗中也得到驗證，即ORI體外處理抗CD3/CD28磁珠活化的小鼠脾臟細(xì)胞后，能顯著抑制小鼠淋巴細(xì)胞因子