NVP-BEZ235對CD34+CD38-髓系白血病干細胞的增殖抑制和免疫增敏.pdf

1、研究背景：
　　 白血病在我國發(fā)病率約為4-5/10萬，他是導致是青少年死亡的首位疾病，它是在造血過程中由于某一階段細胞克隆擴增而產(chǎn)生的造血系統(tǒng)惡性疾病。近來，隨著環(huán)境污染的逐漸加劇，累積損傷造成白血病發(fā)病率越來越高，難治性越來越強。白血病是較常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，是一種造血系統(tǒng)紊亂性疾病。目前治療白血病的方法主要有放療、化療和骨髓移植等，但這幾種方法都面臨著愈后復發(fā)的問題。Bonnet D等首次從AML患者骨髓中首次分離出C

2、D34+CD38-表型的白血病細胞亞群，并將該表型的細胞移植給非肥胖性糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠。發(fā)現(xiàn)該細胞群有強大的自我更新及增殖特點，它能啟動除急性早幼粒細胞白血病(M3)外各型AML的形成，并在二次移植受體鼠體內(nèi)觀察到同樣的結果。至此，人們開始認識到白血病患者體內(nèi)存在白血病干細胞(LSC)被認為是白血病發(fā)生、發(fā)展及治療后復發(fā)的根源，其原因為白血病干細胞(LSC)具有自我更新、多分化潛力及增殖強等特性。目前急性

3、髓系白血病(AML)占白血病的60％。除M3型外，AML各個型別（M0-M5）來源的LSC均表達相同的免疫表型CD34+CD38-，這與正常骨髓HSC表面特征相似。白血病干細胞處于細胞克隆初始階段，與白血病細胞的惡性增殖相關，在白血病的發(fā)生和發(fā)展起關鍵作用。由于白血病干細胞處于細胞分裂的休眠期，使其對常規(guī)劑量藥物和放射損傷產(chǎn)生強大的抵抗力，甚至對人體致死劑量藥物和全身照射也產(chǎn)生耐受和抵抗。臨床上的治療的指導思想增強放化療力度以往往是盡可

4、能提高殺滅白血病細胞的數(shù)目。這樣的治療往往缺乏靶向性，這樣的治療不僅僅有很大的盲目性，而且很難達到真正的治愈，不僅浪費了醫(yī)療資源，而且給患者及家屬帶來了精神上及經(jīng)濟上不必要的痛苦。所以只有靶向白血病干細胞或提高白血病干細胞對放化療的敏感性，才能徹底治療白血病、預防緩解后復發(fā)提高長期存活率，達到真正意義上的生物學緩解。因此目前急需尋找能夠靶向白血病干細胞提高化療有效性的藥物或者新的治療手段以最大限度的清除耐藥和免疫抵抗的白血病細胞，預防復

5、發(fā)。
　　 PI3K/AKT/mTOR信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)。PI3K之所以作為治療腫瘤的靶點引人注目，主要是因為它處于眾多調(diào)節(jié)細胞功能的眾多重要信號通路的關鍵信號位置。磷酸肌醇3-激酶（PI3K: phosphatidyinositol3-kinase）是一個脂激酶家族，目前多指Ⅰ型PI3K，它們可以催化PIP2磷酸化成為PIP3從而激活下游的蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(AKT: prot

6、ein-serine-threonine kinase)。AKT又可磷酸化mTORC1來促進蛋白質合成和細胞生長，還可以通過mTORC1來上調(diào)缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor1α)和血管內(nèi)皮生長因子促進血管生成。另外AKT也可被mTORC2激活。mTOR(mammalian target of rapamycim)是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。處于PI3K信號通路的下游，在細胞中m

7、TOR以mTOR1和mTOR2的催化亞基形式存在，這兩種復合物參與細胞基因轉錄、蛋白質翻譯起始、核糖體生物合成、細胞凋亡等過程。近年來許多研究表明細胞的惡性轉化與該通路的活性異常相關。PI3K/AKT/mTOR信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，所以PI3K/AKT/mTOR信號通路的抑制劑作為新型抗腫瘤藥物得到世界的廣泛關注。NVP-BEZ235是具有咪唑并喹啉結構的ATP競爭性PI3K/mTOR混合抑制劑。目前在實體瘤方面已經(jīng)

8、進入Ⅰ期/Ⅱ期臨床實驗階段。該藥物的喹啉氮原子與激酶鉸鏈部位形成氫鍵，NVP-BEZ235通過ATP競爭抑制PI3K表現(xiàn)出高度抑制PI3K，它選擇性阻斷PI3K催化亞基p110α和p110γ，在增加濃度下也阻斷mTOR1和mTOR2，也可抑制普通的PI3Kα突變。NVP-BEZ235也可顯著減少mTOR激活P70S6激酶蛋白的磷酸化水平。有研究表明在實體瘤方面NVP-BEZ235表現(xiàn)出誘導細胞凋亡及將細胞周期阻滯在Go/G1期。Schu

9、lt C等發(fā)現(xiàn)NVP-BEZ235聯(lián)合細胞毒藥物有抗急性淋巴細胞白血病增殖的作用，Baumann P等發(fā)現(xiàn)NVP-BEZ235對骨髓瘤有抑制骨髓瘤細胞增殖的作用，并與多種藥物如硼替佐米、馬法蘭、阿霉素等有協(xié)同累加作用。然而目前NVP-BEZ235對CD34+CD38-髓系白血病干細胞的作用作者仍未見到報道，既尚不明確NVP-BEZ235能否靶向性殺滅CD34+CD38-髓系白血病干細胞。因此，我們研究NVP-BEZ235對CD34+CD

10、38-髓系白血病干細胞KG1a細胞株的生物學特性的影響，為研究NVP-BEZ235治療急性髓系白血病提供一定的實驗室基礎。
　　 腫瘤的發(fā)生經(jīng)歷了免疫監(jiān)視、相互對抗、免疫逃逸的過程。免疫系統(tǒng)和腫瘤細胞之間存在相互作用，免疫系統(tǒng)重塑腫瘤細胞的抗原性，腫瘤細胞改變免疫效應細胞抗腫瘤效應。白血病之所以能夠發(fā)生，另外一個主要原因為白血病細胞能通過基因突變等多種機制逃逸體內(nèi)的免疫監(jiān)視。逃逸后的白血病干細胞獲得克隆性增殖最終發(fā)展為白血病狀態(tài)

11、。自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)是骨髓來源的大顆粒淋巴細胞，約占人外周血淋巴細胞總數(shù)的5％-10％。NK細胞是機體抵抗腫瘤的第一道防線，在腫瘤監(jiān)控中占重要地位。NK細胞過繼性免疫治療也是目前臨床上腫瘤細胞免疫治療的重要手段。在病毒感染、惡性轉化、化學刺激和炎性反應等壓力誘導下熱休克因子(HSF)參與轉錄調(diào)控促進MICA/B、ULBP1、ULBP2等分子表達從而被受體識別，受體活化后進而激活NK細胞發(fā)殺傷

12、作用。而MICA/B、ULBP1、ULBP2等分子為NK細胞活化性受體NKG2D的配體。研究表明多種血液腫瘤細胞表面表達一定水平的NKG2D配體，且NK細胞的殺傷能力與其NKG2D的表達水平有關。提高NKG2D介導的NK細胞對白血病干細胞的免疫清除率對治療白血病及預防復發(fā)有重要的作用。如何能通過藥物調(diào)節(jié)和逆轉白血病干細胞對免疫系統(tǒng)的抵抗作用，以最大限度的清除白血病干細胞成為我們下一步要研究的。那么NVP-BEZ235能否調(diào)節(jié)KG1a細胞

13、被機體免疫細胞殺傷敏感性成為本實驗第二部分研究內(nèi)容。
　　 本實驗將從NVP-BEZ235對CD34+CD38-KG1a細胞株生物學特性的影響，以及NVP-BEZ235能否調(diào)節(jié)CD34+CD38-KG1a細胞被免疫細胞殺傷的敏感性進行研究，從而為NVP-BEZ235對抗髓系白血病提供體外實驗研究，了解NVP-BEZ235能否增強CD34+CD38-KG1a細胞被殺傷的敏感性。
　　 第一部分:NVP-BEZ235對CD3

14、4+CD38-髓系白血病干細胞生物學特性的影響
　　 [目的]探討PI3K/mTOR信號系統(tǒng)雙靶點抑制劑——NVP-BEZ235對CD34+CD38-髓系白血病干細胞增殖、細胞周期、凋亡和集落形成能力的影響
　　 [方法]收集實驗用KG1a細胞，流式細胞術檢測急性髓系白血病KG1a細胞表面CD34和CD38的表達;臺盼藍染色細胞計數(shù)法檢測不同濃度NVP-BEZ235(0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmo

15、l/L、0.5μmol/L、1μmol/L)和不同作用時間（24小時、48小時）對KG1a細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測不同濃度NVP-BEZ235(完全空白對照、0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L)作用后KG1a細胞周期及凋亡變化;持續(xù)用藥軟瓊脂克隆形成實驗檢測不同濃度NVP-BEZ235(0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1

16、μmol/L)對KG1a細胞集落形成細胞的影響。
　　 應用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，本實驗數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（(X)±S）表示，NVP-BEZ235對KG1a細胞增殖抑制及克隆形成實驗采用方差分析，方差齊時組間多重比較采用LSD法;不同濃度NVP-BEZ235作用下細胞周期及凋亡組間比較采用t檢驗。P＜0.05提示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]流式檢測實驗用KG1a細胞CD34表達率(％)為98.6±0

17、.17，CD38表達率(％)為00.01±0.00。為白血病干細胞發(fā)育水平。DMSO(0μmol/L)對CD34+CD38-KG1a細胞的增殖無影響(P＞0.05)。NVP-BEZ235(0.125～1μmol/L)對KG1a細胞增殖抑制呈現(xiàn)時間和劑量依賴(P＜0.05)。NVP-BEZ235持續(xù)接觸24小時及48小時的IC50值分別為0.597μmol/L和0.102μmol/L。同一時間點各濃度組與0μmol/L組比較差異有統(tǒng)計學意

18、義(P＜0.05);同一濃度不同時間點比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。對照、0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L的NVP-BEZ235作用24h后分別有54.07±7.18％、43.47±9.60％、80.17±3.57％、83.2±3.80％、83.2±3.80％、80.03±1.23％KG1a細胞阻滯在Go/G1期，對照組與0μmol/L組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0

19、.05)，各組與0μmol/L組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CD34+CD38-KG1a經(jīng)過0μmol/L、0.125μmol/L、0.25μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L NVP-BEZ235持續(xù)作用24h后與對照組相比CD34+CD38-KG1a細胞凋亡率未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。NVP-BEZ235(0～1μmol/L)直接持續(xù)作用下14d和21d克隆形成數(shù)目分別由375.67±2

20、1.46、706.33±87.31降至0。0.25μmol/L持續(xù)作用下集落數(shù)和集落大小明顯小于對照組。0.5μmol/L及1μmol/L NVP-BEZ235直接持續(xù)作用下KG1a細胞集落形成明顯受到抑制，14d及21d集落形成數(shù)目為0個，倒置顯微鏡下觀察僅見大量碎片未見集落形成。
　　 [小結]
　　 1.實驗所用KG1a細胞處于白血病干細胞發(fā)育水平。
　　 2.不同濃度下的NVP-BEZ235能抑制CD34

21、+CD38-KG1a細胞的增殖，并具有劑量時間依賴性。
　　 3.NVP-BEZ235能將CD34+CD38-KG1a髓系白血病干細胞阻滯在G0/G1期，NVP-BEZ235對KG1a細胞的增殖能力的抑制可能與其使KG1a細胞阻滯在G0/G1期有關。
　　 4.NVP-BEZ235不能誘導CD34+CD38-KG1a細胞凋亡。
　　 5.NVP-BEZ235顯著抑制CD34+CD38-KG1a細胞集落形成能力，對

22、KG1a細胞中的具有自我更新和增殖潛能的細胞具有抑制克隆形成的能力。
　　 第二部分:NVP-BEZ235對CD34+CD38-髓系白血病干細胞被活化后外周血單個核細胞殺傷的敏感性的影響
　　 [目的]探討NVP-BEZ235對CD34+CD38-髓系白血病干細胞被活化后外周血單個核細胞殺傷的敏感性的影響及其可能機制。
　　 [方法]臺盼藍拒染法檢測IC50值的NVP-BEZ235對外周血單個核細胞增殖的影響。L

23、DH釋放法檢測在效靶比分別為10∶1、20∶1時檢測未經(jīng)過和經(jīng)過500u/LIL-2、20ng/ml IL-15活化后的外周血單個核細胞對CD34+CD38-KG1a細胞的殺傷率。流式細胞儀檢測NVP-BEZ235作用24后KG1a細胞表面NKG2D配體的表達的變化。
　　 應用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，本實驗數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標準差（(X)±S）表示。NVP-BEZ235對PBMC的增殖影響用配對t檢驗。KG1a細胞和經(jīng)

24、過NVP-BEZ235作用前后KG1a細胞被未經(jīng)活化的PBMC及IL-2、IL-15活化的PBMC殺傷的殺傷率用析因設計資料方差分析，NVP-BEZ235作用前后KG1a細胞NKG2D配體的表達使用獨立樣本t檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 [結果]PBMC在0.5μmol/L NVP-BEZ235的作用下與對照組0μmol/L相比，24小時、48小時、72小時生長抑制率分別為0.67±0.29(％)與1.17±0

25、.76(％)、1.67±0.29(％)與1.0±0.5(％)、1.83±0.70(％)與1.83±0.29(％)。各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。未經(jīng)活化的PBMC在效靶比為10∶1和20∶1時，KG1a細胞被其殺傷的殺傷率為4.94±0.54(％)、5.59±0.55(％)二者差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。KG1a細胞被經(jīng)過IL-2、IL-15活化的PBMC在效靶比為10∶1和20∶1時殺傷率分別為25.73±2.4

26、9(％)、35.05±3.39(％)二者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。KG1a細胞被未經(jīng)活化的PBMC在效靶比為10∶1和20∶1殺傷的殺傷率為4.94±0.54(％)、5.95±0.55(％)。經(jīng)過0.5μmol/L的NVP-BEZ235作用后KG1a細胞被PBMC殺傷的殺傷率分別為4.95±1.16(％)、7.00±2.05(％)。KG1a細胞被PBMC殺傷的敏感性有一定程度的提高，但是差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。經(jīng)IL-

27、2、IL-15活化的PBMC在效靶比為10∶1和20∶1時，KG1a細胞被其殺傷的殺傷率為25.73±2.49(％)、35.05±3.39(％)經(jīng)過0.5μmol/L的NVP-BEZ235作用后，KG1a細胞被活化后的PBMC殺傷的殺傷率分別為25.61±4.01(％)、47.49±1.65(％)，二者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。NVP-BEZ235持續(xù)作用于KG1a細胞24小時后，該細胞表面NKG2D的配體表達與NVP-BEZ2

28、35作用前相比較未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 [小結]
　　 1.0.5μmol/L的NVP-BEZ235對PBMC的增殖無明顯影響;
　　 2.活化后的PBMC殺傷效應明顯高于未活化的PBMC細胞;
　　 3.NVP-BEZ235能增強KG1a細胞被PBMC的殺傷敏感性。
　　 [結論]
　　 1.NVP-BEZ235對髓系白血病干細胞具有直接的抑制增殖及克隆形