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文檔簡介
1、第一部分、mTOR 信號通路負調控的自噬在饑餓早期保護多發(fā)性骨髓瘤細胞抵抗凋亡
目的:本研究利用饑餓誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞同時發(fā)生自噬和凋亡,觀察兩者的生物學特征以及相互關系,探討所涉及的分子機制,明確饑餓時多發(fā)性骨髓瘤細胞中自噬的生物學特征。
方法:在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞至對數生長期,然后完全去除培養(yǎng)基內的胎牛血清誘導細胞饑餓狀態(tài)。利用3-甲基腺素(3-Methyladenine,
2、3-MA)抑制自噬。利用MTT 比色法檢測經實驗處理后細胞的增殖活性。分別利用以下技術檢測經實驗處理后的細胞內的自噬水平:MDC(monodansylcadaverine)熒光染色劑熒光標記自噬并用流式細胞術測定熒光強度,western blot免疫印記技術檢測自噬標記蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅰ向LC3Ⅱ的蛋白轉化水平以及Beclin 1 蛋白表達水平,RT-PCR和qRT-PCR檢測Beclin 1的mRNA水平,利用透射電
3、鏡(TEM)直接觀察自噬小體的形成和數量。
利用Annexin V-FITC/PI 流式細胞術和TUNEL 檢測細胞凋亡,利用TEM 直接觀察胞內凋亡的典型形態(tài)學變化。利用western blot 免疫印記技術S6K1的磷酸化水平、活化caspase 3 蛋白水平、Bax 從胞漿向線粒體的轉位水平。分別利用RT-PCR和quantitative RT-PCR(qRT-PCR)檢測Beclin 1和Bax的mRNA 水平。利
4、用SPSS13.0 進行統(tǒng)計分析,p<0.05具有統(tǒng)計學差異。
結果:饑餓誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞發(fā)生自噬,自噬在饑餓6h,12h和18h 呈現時間依賴性上升,自噬在18h 達到最高水平,隨后在24h和48h 出現下降,并在48h 回落至基礎水平,該過程受mTORC1 通路的負性調控;饑餓誘導細胞發(fā)生隨時間時間逐漸上升的凋亡,并在饑餓24h 自噬出現下降時凋亡顯著增加,伴隨凋亡的Bax 轉位和caspase 3 活化說明饑餓誘
5、導細胞發(fā)生線粒體依賴的典型凋亡;3-MA 抑制自噬后,饑餓6h,12h和18h的細胞凋亡和caspase 3 活化增加,而24h和48h 兩者無明顯變化。
結論:饑餓能同時誘導RPMI8226細胞發(fā)生自噬和凋亡;自噬主要發(fā)生在饑餓早期并抑制凋亡的發(fā)生保護腫瘤細胞生存,隨著饑餓的持續(xù),細胞最終走向凋亡;凋亡為RPMI8226細胞死亡的主要方式;mTORC1 通路參與了自噬的調控。
第二部分、饑餓誘導多發(fā)性骨髓瘤
6、細胞發(fā)生時間依賴的自噬和凋亡的分子機制探討
目的:前文已經證實了饑餓同時誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞系細胞發(fā)生自噬和凋亡;自噬與凋亡呈現時間依賴性的變化,饑餓0h,6h,12h,18h 時自噬和凋亡呈現時間依賴性增加,其中自噬增加明顯,而凋亡增加較輕微,而饑餓24h和48h自噬下降,與此同時凋亡爆發(fā);同時發(fā)現自噬受mTORC 負調控,而凋亡則是caspase-3 介導Bax 依賴的經典凋亡途徑。本研究的目的是進一步探討其細胞分子信
7、號機制。
方法:用qRT-PCR和RT-PCR檢測了饑餓0h、6h、12h、18h、24h和48h Deptor、Raf-1、JNK1、JNK2、JNK3、p53、p21以及NFκB1的轉錄水平;利用SPSS13.0統(tǒng)計分析數據。
結果:在RPMI8226細胞中Raf-1、JNK1、JNK2、NFκB1和p21 高度表達,Deptor和p53中度表達,JNK3 低度表達。Deptor 轉錄水平與自噬變化一致在
8、0h、6h、12h和18h 呈現時間依賴性升高繼而在24h和48h下降;Raf-1、JNK1、JNK2、p53、p21 轉錄水平與凋亡變化一致在0h、6h、12h、18h、24h和48h 呈現時間依賴性升高,24h和48h 增加更為明顯;NFκB1 各時間點轉錄水平較0h下降但并未呈現時間依賴性。
結論:上述信號分子均參與了饑餓時細胞反應,Deptor 主要促進細胞自噬,Raf-1/JNK/p53/p21與細胞凋亡密切相關
9、,而NFκB1 抑制細胞凋亡。Deptor是否同時參與調控了細胞自噬和凋亡仍有待證實。
第三部分、冬凌草甲素誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞發(fā)生自噬和凋亡的機制研究
目的:本實驗主要研究冬凌草甲素誘導多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生自噬、凋亡,兩者之間的關系以及所涉及的相關機制。
方法:利用MTT 比色法檢測冬凌草甲素對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞的增殖活性影響;透視電鏡觀察細胞內凋亡和自噬的形態(tài)學改變;Annexin
10、 V-FITC/PI流式細胞術和TUNEL 檢測細胞凋亡;分別利用以下技術檢測處理后的細胞內的自噬變化:使用QDs605nm-Anti-LC3 熒光探針以及免疫熒光技術定位細胞胞內LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白,利用western blot 免疫印記技術檢測LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化水平;利用DCFH-DA 探針以及流式細胞術檢測細胞胞內ROS 水平;western blot免疫印記技術檢測細胞active caspase 3和Beclin 1表達
11、水平以及SIRT1 核蛋白表達水平。
結果:冬凌草甲素能明顯抑制RPMI8226細胞增殖,其抑制作用呈時間、劑量依賴性;冬凌草甲素能同時誘發(fā)呈時間依賴性升高的凋亡和自噬,然而,caspase3依賴的凋亡是冬凌草甲素誘導細胞死亡的主要方式;與此同時,冬凌草甲素誘導呈時間依賴性的細胞胞內ROS 水平升高以及SIRT1 核蛋白表達下降;用NAC完全抑制胞內ROS 產生后,冬凌草甲素無法再誘發(fā)凋亡和自噬,也逆轉了冬凌草甲素對SIR
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