自噬抑制劑3-MA增強順鉑對神經(jīng)母細(xì)胞瘤化療效果及其分子機制的研究.pdf

1、目的：研究通過抑制自噬，增強常規(guī)化療藥物順鉑對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y治療效果的可能性，并探究其可能的分子機制。
　　方法：
　　1.將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞株進行體外培養(yǎng)，采用不同濃度（0、1.25、2.5、5、10、20、40ug/ml）的順鉑分別處理處于對數(shù)生長期的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞24h、48h、72h，及不同濃度（0、1.25、2.5、5、10mM）的3-MA分別處理處于對數(shù)生長期的神經(jīng)母細(xì)

2、胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞24h后，應(yīng)用MTS比色法測定細(xì)胞的存活率，采用不同濃度（0、2.5、5、10、20ug/ml）的順鉑及聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA（5mM）處理處于對數(shù)生長期的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞24h后，應(yīng)用MTS比色法測定細(xì)胞的存活率，并分別計算單獨應(yīng)用順鉑及順鉑聯(lián)合自噬抑制劑后順鉑的IC50值。
　　2.于普通光學(xué)顯微鏡下觀察對照組、常規(guī)化療藥物順鉑（10ug/ml）組、自噬抑制劑3-MA（5mM）組、自噬抑

3、制劑3-MA（5mM）聯(lián)合常規(guī)化療藥物順鉑（10ug/ml）組細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變。
　　3.用同樣的方法處理細(xì)胞后，將四組處理后的細(xì)胞進行PI染色，在熒光顯微鏡下觀察晚期凋亡及壞死細(xì)胞。
　　4.應(yīng)用western blot方法分別檢測上述四組細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)變化情況。
　　實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料均進行正態(tài)性及

4、方差齊性檢驗，經(jīng)檢驗后符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）（M(P25～P75)）表示。經(jīng)檢驗符合正態(tài)分布且方差齊的多組均數(shù)的比較應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA），多組間的兩兩比較采用SNK法（Student-Newman-Keuls）；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)多組比較采用Kruskal-wallis H檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。以α

5、=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.05作為差別顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)順鉑處理人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞24小時后，對細(xì)胞活力影響較小，僅在順鉑濃度到達(dá)10ug/ml時，細(xì)胞存活率有所下降（P<0.05）。順鉑作用48小時后，當(dāng)順鉑濃度到達(dá)5ug/ml時，細(xì)胞活力下降（P<0.01），當(dāng)順鉑濃度到達(dá)10ug/ml時，細(xì)胞活力下降顯著（P<0.001）。順鉑作用72小時后，除濃度為1.25ug/ml組，其余

6、各組細(xì)胞活力均下降顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。不同濃度的自噬抑制劑3-MA單獨作用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞24h后，對細(xì)胞活力無明顯影響，即使3-MA在最大濃度10mmol/L時，細(xì)胞存活率與空白對照組仍無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。單獨應(yīng)用順鉑及聯(lián)合自噬抑制劑3-MA后順鉑的IC50值分別為10.9ug/ml和5.25ug/ml，聯(lián)合自噬抑制劑后順鉑的IC50值降低了49％。
　　2.于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)

7、學(xué)的改變，發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞數(shù)目較多，均貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)較一致，呈長梭形或多角形，體積較小，有聚集成團傾向，細(xì)胞代謝產(chǎn)物較少；自噬抑制劑處理組細(xì)胞數(shù)量無明顯減少，但細(xì)胞凸起不明顯，少量呈現(xiàn)橢圓形，順鉑處理組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)發(fā)生較明顯變化，看不到長梭形狀的細(xì)胞，胞質(zhì)皺縮，多呈圓形或短橢圓形，聚集成團，自噬抑制劑聯(lián)合順鉑組細(xì)胞數(shù)量減少更明顯，且細(xì)胞分散，看不到明顯成團細(xì)胞，培養(yǎng)皿內(nèi)可見大量細(xì)胞產(chǎn)物及死亡細(xì)胞。
　　3.熒光顯微鏡下

8、觀察細(xì)胞的晚期凋亡及壞死情況發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞生長良好，未見晚期凋亡及壞死細(xì)胞，3-MA處理組晚期凋亡及壞死細(xì)胞較對照組無明顯增多，順鉑處理組較對照組及3-MA處理組晚期凋亡及壞死細(xì)胞明顯增多，順鉑聯(lián)合3-MA處理組細(xì)胞的晚期凋亡及壞死率又明顯高于單用順鉑組。
　　4.Western blot檢測結(jié)果顯示：對照組自噬及凋亡相關(guān)蛋白均處于基礎(chǔ)水平，應(yīng)用3-MA抑制自噬后，檢測到自噬相關(guān)蛋白表達(dá)下降，但凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)

9、并未見明顯增高；順鉑處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞24h后，與對照組相比自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)均升高，加入自噬抑制劑后，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)較單獨應(yīng)用順鉑組明顯下降，但凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)較單獨應(yīng)用順鉑組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.順鉑能夠在體外抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞

10、的增值，且在一定的濃度范圍內(nèi)這種抑制作用具有時間、劑量依賴性；
　　2.單獨應(yīng)用自噬抑制劑3-MA24小時，在一定的濃度范圍內(nèi)無明顯抑制增值作用，即單獨抑制自噬并不能有效抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖；
　　3.順鉑聯(lián)合自噬抑制劑3-MA后，可降低順鉑的IC50值，起化療增敏作用；
　　4.順鉑誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞發(fā)生凋亡的同時，自噬作用增強，且自噬在細(xì)胞凋亡過程中起保護作用；
　　5.抑制自噬可以加強順鉑