RNA干擾下NGF誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤分化的研究.pdf

1、目的：神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma，NB)是小兒常見的惡性胚胎源性實體腫瘤，對其進行誘導(dǎo)分化治療是目前研究的焦點。研究表明，N—myc基因在調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤增殖、分化等一系列生理過程中起十分重要的作用。神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor，NGF)不能誘導(dǎo)有N—myc基因擴增的神經(jīng)母細胞瘤細胞產(chǎn)生分化。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種序列特異性、轉(zhuǎn)錄后基因沉默的機制。目前，RNA

2、i技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究和疾病治療。本實驗研究目的：(1)合成4條靶向N—myc的小分子RNA(Small interfering RNA，siRNA)并確定轉(zhuǎn)染體系。(2)篩選出具有最佳抑制效果的小分子RNA(siRNA)，并觀察siRNA特異性抑制N—myc蛋白表達的時效性。(3)研究應(yīng)用RNAi沉默N—myc基因表達后，NGF誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤IMR—32細胞分化的作用。 方法：(1)化學(xué)法合成4條siRNA，并用

3、帶有熒光標(biāo)記的小分子RNA(FAM—siRNA)確定轉(zhuǎn)染體系。(2)Real—Time PCR檢測N—myc mRNA的表達，篩選出具有最佳抑制效果的siRNA，并觀察siRNA特異性抑制N—myc蛋白表達的時效性。(3)通過細胞形態(tài)學(xué)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuronspecific enolase，NSE)的表達、噻唑藍(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法等觀察NGF和MYCN—siRNA1協(xié)

4、同誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤分化的作用。 結(jié)果：(1)化學(xué)法成功合成了4條siRNA。按終濃度80nmol/L設(shè)計轉(zhuǎn)染體系，則Lipofectamine2000與20uM的siRNA母液的體積比為1：2。(2)4條化學(xué)合成的靶向N—myc siRNA皆能抑制N—myc基因的表達，其中5’→3'CGG AGA UGC UGC UUG AGA Adtdt3’→5' UUC UCA AGC AGC AUC UCC Gdtdt(即人MYCN—si

5、RNA1)為最有效的干擾序列。其抑制效果達到89％，與空白對照組差異具有顯著性(P<0.05)。轉(zhuǎn)染MYCN—siRNA1后的1、2、3、5、7天N—myc蛋白的表達率分別為59.1％、39.5％、26.6％、40.0％、57.3％(P<0.05)，轉(zhuǎn)染后第3天N—myc的表達最低。(3)在NGF和MYCN—siRNA1的共同作用下，NB細胞出現(xiàn)了較明顯的細胞形態(tài)學(xué)分化，表現(xiàn)為胞體變小變圓，突起明顯延長，細胞貼壁能力增強，細胞間連接變?nèi)?/p>