RNA干擾VEGF-A--C對神經(jīng)母細胞瘤細胞生長及凋亡的作用及機制研究.pdf

1、目的：構(gòu)建同時表達VEGF-A和VEGF-C的短發(fā)夾RNA真核表達載體，并通過其介導(dǎo)的RNA干擾作用，研究對人神經(jīng)母細胞瘤細胞株IGR-N-91細胞中VEGF-A和VEGF-C的mRNA及其蛋白的表達，以及對細胞生長及凋亡的作用及機制。 方法：分別根據(jù)VEGF-A和VEGF-C的cDNA序列合成八對寡核苷酸片段，退火后分別插入真核表達載體組成重組質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行PCR、測序鑒定驗證后并經(jīng)Western Blot篩選，然后分別

2、將篩選所得的RNA干擾效果最佳的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細胞瘤細胞株IGR-N-91。轉(zhuǎn)染48h后提取總RNA，經(jīng)RT-PCR半定量檢測VEGF-A和VEGF-C mRNA的表達水平，Annexin V和PI雙重標記流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；PI標記后經(jīng)流式細胞儀檢測對IGR-N-91細胞株細胞周期的影響；ELISA分別檢測VEGF-A和VEGF-C蛋白的表達水平；MTT法檢測VEGF-A和VEGF-C表達下降后細胞增殖的情況。 采用

3、分子克隆的方法，將分別得到驗證的VEGF-A和VEGF-C RNA干擾片段切下，構(gòu)建到同一個真核表達載體中，得到一個能夠同時下調(diào)VEGF-A和VEGF-C表達的RNA干擾真核表達載體重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染細胞株IGR-N-91以驗證其效果。 結(jié)果：成功構(gòu)建含有VEGF-A和VEGF-C的RNA干擾片段真核表達載體，經(jīng)Western Blot篩選后分別得到RNA干擾效果最佳的片段。 采用分子克隆的方法，成功將效果最佳

4、的RNA干擾片段插入到同一個重組質(zhì)粒中并經(jīng)PCR和測序驗證；RT-PCR結(jié)果表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細胞瘤后VEGF-A和VEGF-C mRNA受到顯著抑制（p<0.05）；流式細胞儀檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染的外源基因未引起顯著的神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡；ELISA檢測VEGF-A和VEGF-C蛋白的表達水平受到顯著抑制；MTT結(jié)果表明腫瘤細胞的增殖受到顯著抑制；細胞周期發(fā)生顯著性改變。 結(jié)論：成功構(gòu)建同時含有人VEGF-A和VEGF-C RN