RNA干擾VEGF在人滋養(yǎng)細(xì)胞中作用的研究.pdf

1、目的：檢測早孕絨毛、蛻膜組織和絨癌JAR細(xì)胞VEGF基因表達(dá)，構(gòu)建針對血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothel ial growth factor．VEGF)mRNA的特異性的RNA干擾質(zhì)粒載體，觀察轉(zhuǎn)染后VEGF的RNA干擾抑制效應(yīng)，探討VEGF在體外對滋養(yǎng)細(xì)胞的作用，建立RNA干擾技術(shù)平臺，為以后研究妊娠并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，基因診斷與基因治療提供技術(shù)手段。 方法：1．收集20例正常早期妊娠(7-8周)人工流產(chǎn)者絨

2、毛和蛻膜，同時(shí)對購置的人絨癌JAR細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，采用RT-PCR法檢測絨毛、蛻膜及JAR細(xì)胞株VEGF基因的表達(dá)；2．設(shè)計(jì)合成兩對針對VEGF mRNA的RNA干擾核苷酸序列，進(jìn)行兩輪PCR，采用TA克隆對第二輪PCR產(chǎn)物(shVEGF和shVEGF2)進(jìn)行克隆，然后將TA克隆產(chǎn)物和pSUPER質(zhì)粒分別行EcoR工和HindIII雙酶切和膠回收，最后將酶切的pSUPER空載體質(zhì)粒與TA克隆酶切片段進(jìn)行定向連接，轉(zhuǎn)化，再次克隆擴(kuò)增，抽

3、提pSUPER質(zhì)粒；3．首先將人絨癌JAR細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)后分組，第1組為空白對照組，第2組為轉(zhuǎn)染空pSUPER載體組，第3組為轉(zhuǎn)染pSUPER-shVEGFl載體質(zhì)粒組，第4組為轉(zhuǎn)染pSUPER-shVEGF2的載體質(zhì)粒組。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，將空白質(zhì)粒及構(gòu)建的載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染2、3、4人絨癌JAR細(xì)胞株，然后篩選轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株克??；4．觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長情況，流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞增殖情況，RT-PCR法檢測RNA干擾后VEGF的基因表達(dá)

4、。 結(jié)果：1．正常早期妊娠絨毛、蛻膜組織及JAR細(xì)胞中均有VEGF表達(dá)，其中蛻膜組織及JAR細(xì)胞中的VEGF呈強(qiáng)表達(dá)，而絨毛組織vEGF表達(dá)強(qiáng)度明顯低于蛻膜組織和JAR細(xì)胞。2．限制性內(nèi)切酶酶切圖譜顯示TA克隆產(chǎn)物及pSUPER載體酶切成功，DNA測序結(jié)果顯示pMD18-T／PCR-shVEGF2無堿基錯(cuò)配。3．轉(zhuǎn)染后的JAR細(xì)胞株的shVEGFl和shVEGF2質(zhì)粒表達(dá)穩(wěn)定，shVEGF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NVEGF基因表達(dá)明顯受

5、抑，shVEGF1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組VEGF完全不表達(dá)，體外轉(zhuǎn)染shVEGF后細(xì)胞周期無明顯變化。 結(jié)論：1．成功構(gòu)建T VEGF基因mRNA特異性RNA干擾質(zhì)粒載體；2．建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER-shVEGFl，pSUPER-shVEGF2干擾質(zhì)粒的JAR細(xì)胞株；3．轉(zhuǎn)染shVEGF2后JAR細(xì)胞株內(nèi)VEGF基因表達(dá)明顯減少，轉(zhuǎn)染shVEGF1的JAR細(xì)胞株內(nèi)VEGF基因表達(dá)沉默；4．JAR細(xì)胞內(nèi)的VEGF被RNA干擾后，其生長