維甲酸誘導人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞分化過程中核基質蛋白的變化研究.pdf

1、本論文以維甲酸( retinoic acid，RA)處理人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞，鑒定RA對人神經母細胞瘤細胞的終末分化誘導效果。在此基礎上，綜合應用亞細胞蛋白質組學分析、免疫細胞化學、細胞分子生物學等技術，對在SK-N-SH細胞誘導分化過程中核基質蛋白的變化進行了較為系統(tǒng)的研究。分析鑒定和確證了與神經母細胞瘤細胞增殖分化相關的特異核基質蛋白，并研究特異核基質蛋白與人神經母細胞瘤細胞相關癌基因、抑癌基因在細胞內的共定位關系與變化

2、，探索它們在神經母細胞瘤細胞誘導分化過程中的調控作用，以期能夠在較為整體水平上進一步認識神經母細胞瘤細胞癌變與逆轉機理問題，從而找出神經細胞增殖與分化相關的靶向性蛋白。 實驗結果顯示，經1μmol/L RA處理之后，人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的增殖受到抑制，細胞生長抑制率達57.93％，細胞發(fā)生了Go/Gi期阻滯。光鏡和電鏡觀察結果顯示，經1μmol/L RA處理后的SK-N-SH細胞形態(tài)和超微結構發(fā)生恢復性變化，細胞呈極

3、性狀、伸出多個軸突樹突狀突起、細胞逐漸變小變圓并融合在一起形成類似神經節(jié)樣結構，并出現(xiàn)核質比例減小，細胞體積減小，細胞表面微絨毛減少，細胞核形態(tài)趨于規(guī)則、核仁數(shù)目減少，細胞核內異染色質減少、常染色質增多，細胞內線粒體和粗面內質網增多、高爾基體結構更為典型等變化；免疫細胞化學檢測結果顯示，經RA誘導處理后，SK-N-SH細胞內癌基因c-myc、c-fos表達產物減少，抑癌基因p53、p27表達產物增多；同時，RA能夠促進SK-N-SH細胞

4、的神經元特異性標志物NSE、Synaptophysin、MAP2的表達。選擇性抽提整裝光鏡和電鏡觀察顯示，經RA處理的SK-N-SH細胞核基質纖維和中間纖維數(shù)量和層次更加豐富，分布更為均勻，單絲成份增多，與核纖層聯(lián)系更為緊密，形成貫穿整個核質區(qū)域的較為規(guī)則的纖維網絡。雙向凝膠電泳與MALDI-TOF質譜分析共鑒定出41個在RA誘導分化前后表達差異的核基質蛋白，其中在分化的SK-N-SH細胞中表達上調的蛋白點為：Vimentin、MTMR

5、2、SUMO-3等；表達下調的蛋白為TRPV2、Nucleophosmin、Prohibitin等；處理后消失的蛋白為ATP synthase beta chain、PSB3;處理后新出現(xiàn)的蛋白為LGII、SYCEI。蛋白質印跡雜交與免疫熒光顯微鏡觀察確證了Nucleophosmin(NPM)、Prohibitin(PHB)、Vimentin和hnRNP A2/BI在SK-N-SH細胞分化過程中的表達變化及其在核基質上的定位。激光共聚焦

6、顯微鏡觀察顯示NPM、PHB和hnRNP A2/B1與癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表達產物在細胞內均存在一定的共定位關系，并且它們的表達水平和細胞定位在誘導分化前后均發(fā)生了改變。激光共聚焦顯微鏡觀察結果還顯示NSE、SYP和MAP2與癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、Rb表達產物在細胞內也存在一定的共定位關系，它們的表達水平和細胞定位在誘導分化前后也發(fā)生了變化。 研究結果表明，1μmol/L R

7、A能有效抑制人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞的增殖活動，改變SK-N-SH細胞形態(tài)與超微結構特征，下調癌基因c-myc、c-fos和上調抑癌基因p53、p27等的表達，從而對人神經母細胞瘤細胞的分化具有顯著誘導效果。在SK-N-SH細胞分化過程中，其核基質.中間纖維系統(tǒng)構型產生了與正常細胞相似的恢復性變化，并且出現(xiàn)了多種差異表達的核基質蛋白，其中NPM、PHB、Vimentin和hnRNP A2/B1為不同誘導分化物誘導多種腫瘤細胞分化

8、后出現(xiàn)的共同差異核基質蛋白。而功能性共同差異核基質蛋白NPM、PHB、hnRNP A2/B1和神經元特異表達標志物NSE、SYP、MAP2與c-Myc、c-Fos、P53、Rb等均存在共定位關系并在SK-N-SH細胞分化過程中出現(xiàn)分布和位移變化的現(xiàn)象。由此證實了RA能夠干預SK-N-SH細胞相關癌基因、抑癌基因的活性，改變一些與基因表達調控和細胞信號轉導相關的重要核基質蛋白的表達，進而阻滯細胞周期，促使人神經母細胞瘤細胞分化。這為我們在