活性氧介導(dǎo)2-ME誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB)為兒童常見的顱外實(shí)體腫瘤之一。盡管傳統(tǒng)的治療手段對(duì)提高神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的生存率已有一定程度的提高，但是兒童高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人的治愈率仍不盡令人滿意。2.甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)是雌激素的天然代謝產(chǎn)物，對(duì)于多種腫瘤均顯示出良好的抗腫瘤活性。然而，2-ME對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma)的作用機(jī)制至今尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察2-

2、ME單獨(dú)和與臨床化療藥物聯(lián)合用藥對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH的作用并初步探討其機(jī)制。
　　 方法：Trypan blue法檢測(cè)SK-N-SH細(xì)胞8天內(nèi)的生長(zhǎng)曲線。SRB法檢測(cè)不同濃度2-ME單獨(dú)和與臨床化療藥物聯(lián)合用藥對(duì)SK-N-SH細(xì)胞增殖的抑制作用以及VC、L-GSH以及靶向線粒體抗氧化劑MitoQ10對(duì)2-ME抑制SK-N-SH細(xì)胞增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)Annexin-V/FITC標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。Hoechs

3、t33258熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。利用熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。Rhodamine123染色檢測(cè)線粒體膜電位的變化。Western blot來檢測(cè)2-ME處理過的SK-N-SH細(xì)胞Bcl-2、Bax和caspase-3，caspase-9，pERK蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：2-ME單獨(dú)應(yīng)用對(duì)SK-N-SH細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，同時(shí)2-ME與環(huán)磷酰胺，5-氟尿嘧啶，順鉑，阿霉素聯(lián)合用藥具有明顯的協(xié)同

4、作用(CI<1)，但2-ME與依托泊苷聯(lián)合用藥具有明顯拮抗作用(CI>1)，并且抑制效應(yīng)在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。VC可以使2-ME抑制SK-N-SH增殖72h的IC50由1.88μM升高到3.75μM，加入L-GSH及MitoQ10后，2-ME作用72h的抑制率明顯降低，與2-ME相比有顯著差異(P<0.05)。流式細(xì)胞儀顯示2-ME將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。Hoechst33258熒光染色結(jié)果表明2-ME作用72h后細(xì)胞核致密濃染

5、，核縮小，凋亡率分別為47.32％，71.56％。DCFH-DA檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)的活性氧顯著升高，MitoQ10阻斷2-ME引起的線粒體活性氧的升高。Rhodamine123染色表明2-ME作用72h細(xì)胞線粒體膜電位下降，而L-GSH，MitoQ10均能阻斷2-ME引起的線粒體膜電位的下降。Western blot檢測(cè)表明2-ME作用SK-N-SH細(xì)胞48h后，Bcl-2/Bax蛋白的比值表達(dá)下調(diào)，caspase-9，caspase-

6、3蛋白則表達(dá)上調(diào)，但是MitoQ10阻斷2-ME引起B(yǎng)cl-2/Bax和Caspase-9 caspase-3蛋白表達(dá)的變化。2-ME作用20min明顯抑制SK-N-SH細(xì)胞pERK蛋白水平，而MitoQ10并不阻斷2-ME引起的pERK蛋白水平的變化。
　　 結(jié)論：2-ME單獨(dú)和與臨床化療藥物聯(lián)合用藥均能能抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH增殖，2-ME誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤的凋亡與線粒體內(nèi)ROS的積聚升高有關(guān)，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)2-ME