活性氧誘導家蠶細胞凋亡的內源性線粒體途徑的研究.pdf

1、細胞凋亡，由基因控制并能夠自主有序的死亡，具有一系列的形態(tài)學及生化特征，在細胞發(fā)育、分化、增殖及壓力應激等生命歷程上起著關鍵作用。氧壓能夠調節(jié)和控制細胞生存，由活性氧介導的高氧壓可以誘導細胞凋亡。家蠶作為鱗翅目昆蟲的模式生物，逐漸成為研究熱點，但對氧壓誘導家蠶細胞凋亡的研究尚處于初級階段，其相應的凋亡途徑的研究目前還不清楚。本研究基于已報道的家蠶凋亡相關基因，與具有較強抗氧化防御系統(tǒng)的鱗翅目典型代表草地貪夜蛾細胞相比較，論證了活性氧介導

2、的高氧壓誘導家蠶細胞凋亡有線粒體信號通路的參與，這將為進一步解析家蠶細胞凋亡的機制奠定基礎。本文主要研究結果如下:
　　1.活性氧誘導家蠶BmN-SWU1細胞凋亡模型的建立
　　用0.1μM、1μM、5μM及10μMH2O2分別處理BmN-SWU1與sf9細胞0-24h、0-12h，，采用MTT分析、DAPI染色、流式分析及TUNEL染色的方法分別檢測細胞的活力、形態(tài)、凋亡率及DNA斷裂。結果發(fā)現(xiàn):用1μM H2O2分別處理

3、兩種細胞24h、12h時，細胞致死率接近50％，且DNA發(fā)生了斷裂。隨著處理時間的延長，細胞呈現(xiàn)一系列的凋亡特征:細胞皺縮、胞質凝聚、凋亡小體出現(xiàn)，且細胞凋亡的發(fā)生對H2O2呈時間依賴性。綜上，1μMH2O2分別處理BmN-SWU1與sf9細胞24h、12h，是誘導兩種昆蟲細胞凋亡的最佳條件。
　　2.活性氧誘導家蠶BmN-SWU1細胞凋亡的內源性線粒體途徑的研究
　　1μM H2O2分別處理BmN-SWU1與sf9細胞不同

4、時間，隨著時間延長，線粒體分布逐漸由均勻分布向簇狀、彌散狀分布轉化，表明H2O2影響兩種昆蟲細胞內的線粒體分布;同時檢測到線粒體膜電位呈時間依賴性下降，流式結果還顯示在BmN-SWU1細胞中，8h與0h時的線粒體膜電位相比，無顯著性差異。與此同時，與H2O2誘導前相比，誘導后的細胞胞質內ROS與Ca2+水平也逐漸升高。qPCR分析表明:H2O2可通過上調BmDronc、Bmapaf-1、BmICE，BmEndoG、BmP53、BmDre

5、dd和下調BmBuffy，BmIAP基因的表達，誘導BmN-SWU1細胞凋亡。免疫熒光和western-blot結果表明:H2O2可以促進細胞色素C的表達，并從線粒體向胞質釋放，除此之外，還可上調P53和下調Bcl-2蛋白的表達。Caspase-9與3/7酶活性檢測結果顯示:H2O2處理BmN-SWU1與sf9細胞不同時間后，其Caspase-9與Caspase-3/7酶活性升高。綜上，本研究論證了H2O2介導的氧壓誘導家蠶BmN-SW