胰腺干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、糖尿病是繼心血管疾病、癌癥之后嚴重危害人類健康的第三大疾病，治療該病常采用的方法有藥物治療、胰島素注射和胰島移植，臨床上大多數(shù)患者常選擇前兩種方法，這主要是因為選用胰島移植雖然能根治糖尿病，但是供體數(shù)量遠遠不足，那么，得到足夠數(shù)量的移植用胰島就顯得尤為重要。研究表明，胰腺干細胞（Pancreas Stem Cells，PSCs）在體外誘導(dǎo)為胰島樣細胞團，并有胰島素分泌功能，那么，對于PSCs的體外分離、培養(yǎng)與生物學特性的研究將為其作為種

2、子細胞，移植治療糖尿病有著重要意義，所以本研究以新生大鼠和小鼠為材料，進行PSCs體外分離、培養(yǎng)與鑒定，并檢測其胰島素的分泌，初步探討枸杞提取物和枸杞多糖在細胞水平對胰腺干細胞增殖和胰島素分泌的影響，為PSCs作為種子細胞應(yīng)用于臨床糖尿病的治療提供參考。通過試驗獲得以下結(jié)果：
　　 1． PSCs體外培養(yǎng)體系的篩選
　　 將獲得的原代新生大鼠胰腺源性細胞以相同細胞密度分別接種于A(RPMI1640+5%FBS+10 ng

3、/mL EGF+10 ng/mL bFGF)、B(RPMI1640+5%FBS)、C(RPMI1640+10%KSR+10 ng/mL EGF+10 ng/mL bFGF)和D(RPMI1640+5%FBS+等體積的含bFGF、LIF的條件培養(yǎng)液)4種培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后進行細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，A液中，細胞大部分呈成纖維生長，貼壁率達90%以上，B液中，細胞的貼壁率只有50%左右，C液中，細胞貼壁呈集落樣生長，貼壁率約為10%

4、左右，D液中貼壁率約為30%左右。利用MTT繪制這4種培養(yǎng)液中細胞的生長曲線，其結(jié)果與觀察到的細胞生長狀態(tài)一致。這表明A液較其它培養(yǎng)液更適合于胰腺源性細胞在體外的生長增殖，其后試驗將以A液作為PSCs的培養(yǎng)用液。
　　 2．大鼠PSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 利用組織塊法分離新生大鼠胰腺源性細胞，在A液中進行培養(yǎng)、免疫組化分析、誘導(dǎo)為胰島樣細胞團行DTZ染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰腺源性細胞呈Nestin、PDX-1、GLU

5、T-2染色陽性，經(jīng)10 mmol/L NIC誘導(dǎo)4 d后細胞呈圓形，20 d后細胞被誘導(dǎo)成胰島樣細胞團，經(jīng)DTZ染色呈陽性，并對其上清進行C肽分析，初步試驗結(jié)果表明，枸杞子提取物和枸杞多糖對大鼠PSCs具有促生長和促胰島素分泌作用。對其進行傳代建系，最高傳至11代。
　　 3．小鼠PSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 利用組織塊法分離新生小鼠胰腺源性細胞，在A液中進行培養(yǎng)、免疫組化分析、誘導(dǎo)為胰島樣細胞團行DTZ染色分析，結(jié)