人胎兒胰島樣細(xì)胞團(tuán)源胰腺干細(xì)胞分離和鑒定.pdf

1、糖尿病作為嚴(yán)重危害人類健康的三大主要疾病之一，傳統(tǒng)的藥物及胰島素替代療法不能從根本上醫(yī)治該病。近年來，隨著成人胰島移植的成功和對(duì)免疫抑制方案的改進(jìn)，移植胰島細(xì)胞已成為治愈Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的有效途徑。但是，由于每個(gè)臨床胰島移植受體通常需要2～4個(gè)新鮮尸體胰腺，胰島供體短缺的矛盾阻礙了胰島細(xì)胞治療糖尿病技術(shù)的推廣和應(yīng)用。 胰腺干細(xì)胞(Pancreatic stem cells)是一類存在于胎兒和成年胰腺組織中的成體干細(xì)胞，能自我

2、更新，具有多分化潛能，其特點(diǎn)是在自然分化過程中首先分化為胰腺組織的各種細(xì)胞。體外分離、克隆人類胰腺干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，并定向誘導(dǎo)其分化為功能性胰島細(xì)胞移植治療糖尿病，是解決胰島供體短缺的有效途徑。本試驗(yàn)從人胎兒胰腺分離胰島樣細(xì)胞團(tuán)(Islet-like cell clusters，ICCs)，從中純化出干細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，對(duì)其表達(dá)特性及誘導(dǎo)分化等方面進(jìn)行研究，從而優(yōu)化胰腺干細(xì)胞分離、鑒定的方法和體系，為糖尿病研究和治療提供種子細(xì)胞，為

3、人胎兒胰腺干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。 本實(shí)驗(yàn)無菌取3-5月齡人胎兒胰腺，剪碎后用Ⅳ型膠原酶消化，RPMI1640+10％NBS培養(yǎng)獲得胰島樣細(xì)胞團(tuán)；挑出細(xì)胞團(tuán)接種于明膠包被的玻璃皿中，低糖DMEM+10％NBS+10ng/mL EGF進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長成單層后傳代，以RPMI1640+10％NBS培養(yǎng)；傳代4d后可見許多呈克隆樣生長的上皮樣細(xì)胞片，挑出用RPMI1640+10％NBS擴(kuò)增培養(yǎng)，獲得純化的上皮樣細(xì)胞，現(xiàn)傳4

4、5代，每代凍存10<'6>-10<'8>個(gè)細(xì)胞。隨機(jī)取生長狀態(tài)良好的第13代細(xì)胞，接種到96孔板中，采用MTT法測定并繪制細(xì)胞生長曲線。生長曲線顯示，用20％血清培養(yǎng)時(shí)，其傳代第三天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，第五天達(dá)到平臺(tái)期，在10％血清的培養(yǎng)液中生長則相對(duì)較慢。將第6代、11代、21代細(xì)胞分別接種于96孔板中，培養(yǎng)三天后4％多聚甲醛(pH7.4)固定后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。細(xì)胞表達(dá)PDX-1、CK-19、PCNA、CK-7、CK-3、E-鈣粘素

5、、Nestin、Glucagon、Glut2、Vimentin、；不表達(dá)Insulin、Somatostatin、IAPP(Islet amyloid polypeptide)。提取第39代細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR分析，細(xì)胞也表達(dá)PDX-1，CK-7，CK-19，Nestin，胰高血糖素，β-半乳糖苷酶，Vimentin，Glut2，不表達(dá)NGN3，胰島素，生長抑素，胰多肽，葡萄糖激酶等。懸浮培養(yǎng)時(shí)CK-19表達(dá)仍然比較強(qiáng)，但nes

6、tin表達(dá)明顯減弱。將培養(yǎng)的第5代細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測，細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CDl66，不表達(dá)CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。第39代細(xì)胞仍穩(wěn)定表達(dá)CD29、CD44、CD166；穩(wěn)定不表達(dá)CD54、CD90、CD11a。而CD14、CD34、CD45、CD105、CD117、CD 71、CD34、CD45的表達(dá)不穩(wěn)定。將第39代HFIECs用10μg/L 10mmol/NIC，10μ