人胎兒胰島樣細胞團源胰腺干細胞分離和鑒定.pdf

1、糖尿病作為嚴重危害人類健康的三大主要疾病之一，傳統(tǒng)的藥物及胰島素替代療法不能從根本上醫(yī)治該病。近年來，隨著成人胰島移植的成功和對免疫抑制方案的改進，移植胰島細胞已成為治愈Ⅰ型和部分Ⅱ型糖尿病的有效途徑。但是，由于每個臨床胰島移植受體通常需要2～4個新鮮尸體胰腺，胰島供體短缺的矛盾阻礙了胰島細胞治療糖尿病技術的推廣和應用。 胰腺干細胞(Pancreatic stem cells)是一類存在于胎兒和成年胰腺組織中的成體干細胞，能自我

2、更新，具有多分化潛能，其特點是在自然分化過程中首先分化為胰腺組織的各種細胞。體外分離、克隆人類胰腺干細胞作為種子細胞，并定向誘導其分化為功能性胰島細胞移植治療糖尿病，是解決胰島供體短缺的有效途徑。本試驗從人胎兒胰腺分離胰島樣細胞團(Islet-like cell clusters，ICCs)，從中純化出干細胞并進行擴增培養(yǎng)，對其表達特性及誘導分化等方面進行研究，從而優(yōu)化胰腺干細胞分離、鑒定的方法和體系，為糖尿病研究和治療提供種子細胞，為

3、人胎兒胰腺干細胞的臨床應用提供基礎資料。 本實驗無菌取3-5月齡人胎兒胰腺，剪碎后用Ⅳ型膠原酶消化，RPMI1640+10％NBS培養(yǎng)獲得胰島樣細胞團；挑出細胞團接種于明膠包被的玻璃皿中，低糖DMEM+10％NBS+10ng/mL EGF進行貼壁培養(yǎng)，當細胞長成單層后傳代，以RPMI1640+10％NBS培養(yǎng)；傳代4d后可見許多呈克隆樣生長的上皮樣細胞片，挑出用RPMI1640+10％NBS擴增培養(yǎng)，獲得純化的上皮樣細胞，現(xiàn)傳4

4、5代，每代凍存10<'6>-10<'8>個細胞。隨機取生長狀態(tài)良好的第13代細胞，接種到96孔板中，采用MTT法測定并繪制細胞生長曲線。生長曲線顯示，用20％血清培養(yǎng)時，其傳代第三天進入對數(shù)生長期，第五天達到平臺期，在10％血清的培養(yǎng)液中生長則相對較慢。將第6代、11代、21代細胞分別接種于96孔板中，培養(yǎng)三天后4％多聚甲醛(pH7.4)固定后進行免疫組織化學染色。細胞表達PDX-1、CK-19、PCNA、CK-7、CK-3、E-鈣粘素

5、、Nestin、Glucagon、Glut2、Vimentin、；不表達Insulin、Somatostatin、IAPP(Islet amyloid polypeptide)。提取第39代細胞總RNA進行RT-PCR分析，細胞也表達PDX-1，CK-7，CK-19，Nestin，胰高血糖素，β-半乳糖苷酶，Vimentin，Glut2，不表達NGN3，胰島素，生長抑素，胰多肽，葡萄糖激酶等。懸浮培養(yǎng)時CK-19表達仍然比較強，但nes

6、tin表達明顯減弱。將培養(yǎng)的第5代細胞上流式細胞儀檢測，細胞表達CD29、CD44、CDl66，不表達CD11a、CD14、CD34、CD45、CD90、CD105、CD117。第39代細胞仍穩(wěn)定表達CD29、CD44、CD166；穩(wěn)定不表達CD54、CD90、CD11a。而CD14、CD34、CD45、CD105、CD117、CD 71、CD34、CD45的表達不穩(wěn)定。將第39代HFIECs用10μg/L 10mmol/NIC，10μ