新生豬胰腺干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、隨著生活水平的提高，糖尿病的患病率日益增高，已成為繼心血管疾病、腫瘤之后第三大高發(fā)慢性病?？焖佟⒂行?、長期地補(bǔ)充機(jī)體胰島素是治療糖尿病的根本方案。目前采用的三種補(bǔ)充機(jī)體胰島素分泌不足的方法中，以移植功能胰腺干細(xì)胞的效果最好，因?yàn)楦杉?xì)胞增殖能力強(qiáng)、數(shù)量充足，移植后排斥反應(yīng)低，并且機(jī)體還可根據(jù)需要，調(diào)節(jié)產(chǎn)生胰島素和其他輔助細(xì)胞因子等的多種細(xì)胞比例，避免并發(fā)癥發(fā)生。但是由于供體細(xì)胞的嚴(yán)重匱乏限制了其廣泛的應(yīng)用，于是人們轉(zhuǎn)向?qū)ふ耶惙N動物胰腺干細(xì)

2、胞作為供體細(xì)胞來源。在研究中發(fā)現(xiàn)，新生豬胰腺干細(xì)胞可作為最佳的異種動物胰腺干細(xì)胞的供體細(xì)胞，對新生豬胰腺干細(xì)胞的研究是治療糖尿病的新希望。本試驗(yàn)從新生豬胰腺干細(xì)胞分離培養(yǎng)、鑒定兩個(gè)方面進(jìn)行研究，建立新生豬胰腺干細(xì)胞的最佳分離培養(yǎng)和鑒定體系。 1.建立新生豬胰腺細(xì)胞的分離培養(yǎng)體系。 取新鮮的新生豬胰腺組織，經(jīng)處理后操作，0.1％v型膠原酶+0.25％胰酶消化，形成小細(xì)胞團(tuán)和單個(gè)細(xì)胞，過濾，低速、多次離心，或以特殊離心液離心

3、，均可獲得高活力的胰腺細(xì)胞，用成纖維細(xì)胞或多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿，以低糖DMEM培養(yǎng)液添加15％血清及10 mmol/L煙堿作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，采用連續(xù)分離培養(yǎng)4d后，除去未貼壁細(xì)胞，更換為去除煙堿、添加10 ng/mL EGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，長期培養(yǎng)以促進(jìn)胰腺細(xì)胞體外增殖生長。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證新生豬胰腺存在多種干細(xì)胞。 2.新生豬胰腺干細(xì)胞的形態(tài)觀察和鑒定。 原代細(xì)胞以細(xì)胞團(tuán)和單個(gè)細(xì)胞貼壁，細(xì)胞團(tuán)中不斷有細(xì)胞脫離、懸浮，保留的貼壁細(xì)胞

4、和單個(gè)細(xì)胞生長，約8d出現(xiàn)多突起干細(xì)胞明顯增多，克隆樣生長，很快連接成網(wǎng)狀；小圓細(xì)胞數(shù)量增多；多角形導(dǎo)管上皮干細(xì)胞增殖慢。倒置顯微鏡觀察多突起細(xì)胞具50～80μm長突起、有極性、核質(zhì)比大、細(xì)胞器不發(fā)達(dá)；小圓細(xì)胞為直徑10～12μm、CK7陽性；多角形細(xì)胞呈圓形、核質(zhì)比大、可見胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)小分泌顆粒。本實(shí)驗(yàn)成功地分離到四種形態(tài)的胰腺干細(xì)胞：多角形細(xì)胞、多突起內(nèi)細(xì)胞、長梭形和小圓細(xì)胞。免疫組化鑒定，分離的細(xì)胞不僅表達(dá)胰腺干細(xì)胞的標(biāo)志PD