成人牙髓干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、牙齒由牙釉質、牙本質、牙骨質三種硬組織和一種軟組織——牙髓構成，其中牙釉質不具備再生能力，牙骨質的再生有限，只有牙本質-牙髓復合體終生都在進行再生。之所以能夠這樣，是因為牙髓中除了成牙本質細胞這種終末分化細胞外，還存在著未分化的間充質細胞。這群細胞在成牙本質細胞受到外界刺激而死亡的時候，能夠在沒有上皮成分作用的情況下分化成成牙本質樣細胞，分泌有機基質并礦化，形成類牙本質。這些間充質細胞又稱為牙髓干細胞，于2000年首先被分離出來。它們具

2、有能夠形成牙髓牙本質復合體的特點，因此成為牙齒組織工程可能的種子細胞來源。已知組織工程學的三大要素是種子細胞、支架材料和生長因子，其中種子細胞來源一直是困擾學者們的難題。因此，本實驗的目的是擬在體外分離和培養(yǎng)人牙髓干細胞基礎上，對其標志及多向分化能力進行檢測，同時將牙髓干細胞與支架材料復合，觀察其形成礦化組織及牙本質牙髓樣復合體的情況，從而尋找一種牙齒組織工程可能的種子細胞來源和交加的生物相容性材料，同時亦為牙髓干細胞的研究提供理論和實

3、驗依據(jù)。 本研究共分為以下四部分進行： 對于左室質量指數(shù)(LVMI)，A、B、C組均較正常對照組顯著升高，B、C、D組較A組LVMI值顯著降低，D組較B、C組LVMI值顯著降低。 2)對于腎素、血管緊張素Ⅱ、醛固酮濃度，A-D組較正常對照組均顯著升高，B組Ang Ⅱ、ALD較A組顯著降低；C、D組較A組PRA、Ang Ⅱ濃度顯著升高，ALD濃度顯著降低；D組PRA、Ang Ⅱ濃度介于B、C組之間，未達到統(tǒng)計學差異

4、，ALD的比較也未見顯著異常；C組較B組Ang Ⅱ濃度顯著升高。 3)心肌聲學密度測量結果高血壓治療前(A組)較正常對照組CA11、CA12顯著升高，PP11顯著降低；B組較正常對照組CA12顯著升高；D組較正常對照組PP11顯著升高；其它數(shù)值的比較均未有顯著差異。A、B、C、D四組之間的比較得出，B、C、D組較高血壓對照組(A組)室間隔、左室后壁CA11、CA12顯著降低，PP11顯著升高，而A組左室后壁的PP12值只有與D

5、組比較，有顯著性差異：B組較C組各項值均未達到顯著性差異：D組較B、C組CA11、CA12顯著降低，PP114、PP12顯著升高。 4)對于PCⅢ，四組均較正常對照組顯著升高；B、C、D組較A組PCⅢ顯著降低，B、C組之間此值無顯著性差異，D組較B、C組PCⅢ顯著降低。 5)ATlR、AT2R mRNA凝膠電泳結果顯示，A組較正常對照組、C組、D組AT1受體表達顯著升高，較B組雖有升高，但未達到統(tǒng)計學意義；本實驗中，AT

6、2受體的表達各組均未達到統(tǒng)計學意義。 6)動態(tài)血壓與。腎素、血管緊張素Ⅱ的關系高血壓組中腎素增高者(1組)31例，腎素不高者(2組)44例，與正常對照組比較，1組及2組動態(tài)血壓各參數(shù)值均顯著升高(P<0．01)；與2組比較，1組PRA、AngⅡ、夜間SBP、DBF、24hSBP均．顯著升高。 7)動態(tài)血壓與左室質量指數(shù)關系左室重量指數(shù)與夜間收縮壓和舒張壓的相關性比晝間更密切，與收縮壓相關性大于舒張壓，SIS、SID與L

7、VMI成負相關。 8)PCⅢ與聲學密度各參數(shù)之間的相關分析PCⅢ與CA11、CA12呈正相關，與PP11、PP12呈反相關。 結論:1)高血壓病人24h動態(tài)血壓指標較正常對照組顯著升高，給予纈沙坦或貝那普利后各項指標顯著下降，聯(lián)合纈沙坦+貝那普利較分別應用能更平穩(wěn)的控制血壓。分別應用貝那普利或纈沙坦后，SI升高，二者比較未達到統(tǒng)計學差異，DSPPmRNA表達情況的變化，觀察不同濃度的兩種因子單獨作用情況下對細胞增殖和分化

8、的影響。然后選取兩種因子的適宜濃度進行聯(lián)合作用觀察其對牙髓干細胞增殖和分化的影響。結果發(fā)現(xiàn)，100ng／m1BMP2和10ng／ml TGFβ1對DPSCs增殖和分化作用最明顯，TGFβ1+BMP<,2>聯(lián)合作用組第4天和第7天時，與其它各組之間堿性磷酸酶活性無顯著性差異(P>0.05)。第14天和21天時，TGF—β110ng組，BMP<,2>100ng組，TGF—βl lOng+BMP<,2>100ng組的堿性磷酸酶活性與對照組細胞

9、比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，堿性磷酸酶活性值均高于同一天的對照組，其中TGF一βl10ng+BMP<,2> 100ng組堿性磷酸酶活性增高明顯，與另外3組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。TGF—βl 10ng+BMP<,2>100ng聯(lián)合作用組DSPP基因的表達較TGF—βl 10ng及BMP<,2>100n明顯增高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 第四部分：成人牙髓干細胞與材料復合的體內外實驗研究為進一步觀察牙髓

10、干細胞與生物材料復合后體內外生長的特性，本實驗將細胞懸液與β—TCP復合培養(yǎng)1天，3天，7天，14天后用掃描電鏡對細胞材料復合物進行了檢測。在此基礎上選取細胞材料復合培養(yǎng)3天的復合物回植于裸鼠背部皮下，4周、12周后取材，進行HE染色、Manory染色以及免疫組織化學檢測。結果發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)時間延長，細胞數(shù)量和基質分泌增多，生長良好。在體內試驗12周后可見不典型的牙本質形成，以及纖維結締組織和小的血管，DSP和I型膠原陽性。