成人牙髓干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、牙齒由牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)三種硬組織和一種軟組織——牙髓構(gòu)成，其中牙釉質(zhì)不具備再生能力，牙骨質(zhì)的再生有限，只有牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體終生都在進(jìn)行再生。之所以能夠這樣，是因?yàn)檠浪柚谐顺裳辣举|(zhì)細(xì)胞這種終末分化細(xì)胞外，還存在著未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。這群細(xì)胞在成牙本質(zhì)細(xì)胞受到外界刺激而死亡的時(shí)候，能夠在沒有上皮成分作用的情況下分化成成牙本質(zhì)樣細(xì)胞，分泌有機(jī)基質(zhì)并礦化，形成類牙本質(zhì)。這些間充質(zhì)細(xì)胞又稱為牙髓干細(xì)胞，于2000年首先被分離出來。它們具

2、有能夠形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的特點(diǎn)，因此成為牙齒組織工程可能的種子細(xì)胞來源。已知組織工程學(xué)的三大要素是種子細(xì)胞、支架材料和生長因子，其中種子細(xì)胞來源一直是困擾學(xué)者們的難題。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的是擬在體外分離和培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞基礎(chǔ)上，對(duì)其標(biāo)志及多向分化能力進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將牙髓干細(xì)胞與支架材料復(fù)合，觀察其形成礦化組織及牙本質(zhì)牙髓樣復(fù)合體的情況，從而尋找一種牙齒組織工程可能的種子細(xì)胞來源和交加的生物相容性材料，同時(shí)亦為牙髓干細(xì)胞的研究提供理論和實(shí)

3、驗(yàn)依據(jù)。 本研究共分為以下四部分進(jìn)行： 對(duì)于左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)，A、B、C組均較正常對(duì)照組顯著升高，B、C、D組較A組LVMI值顯著降低，D組較B、C組LVMI值顯著降低。 2)對(duì)于腎素、血管緊張素Ⅱ、醛固酮濃度，A-D組較正常對(duì)照組均顯著升高，B組Ang Ⅱ、ALD較A組顯著降低；C、D組較A組PRA、Ang Ⅱ濃度顯著升高，ALD濃度顯著降低；D組PRA、Ang Ⅱ濃度介于B、C組之間，未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

4、，ALD的比較也未見顯著異常；C組較B組Ang Ⅱ濃度顯著升高。 3)心肌聲學(xué)密度測(cè)量結(jié)果高血壓治療前(A組)較正常對(duì)照組CA11、CA12顯著升高，PP11顯著降低；B組較正常對(duì)照組CA12顯著升高；D組較正常對(duì)照組PP11顯著升高；其它數(shù)值的比較均未有顯著差異。A、B、C、D四組之間的比較得出，B、C、D組較高血壓對(duì)照組(A組)室間隔、左室后壁CA11、CA12顯著降低，PP11顯著升高，而A組左室后壁的PP12值只有與D

5、組比較，有顯著性差異：B組較C組各項(xiàng)值均未達(dá)到顯著性差異：D組較B、C組CA11、CA12顯著降低，PP114、PP12顯著升高。 4)對(duì)于PCⅢ，四組均較正常對(duì)照組顯著升高；B、C、D組較A組PCⅢ顯著降低，B、C組之間此值無顯著性差異，D組較B、C組PCⅢ顯著降低。 5)ATlR、AT2R mRNA凝膠電泳結(jié)果顯示，A組較正常對(duì)照組、C組、D組AT1受體表達(dá)顯著升高，較B組雖有升高，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；本實(shí)驗(yàn)中，AT

6、2受體的表達(dá)各組均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 6)動(dòng)態(tài)血壓與。腎素、血管緊張素Ⅱ的關(guān)系高血壓組中腎素增高者(1組)31例，腎素不高者(2組)44例，與正常對(duì)照組比較，1組及2組動(dòng)態(tài)血壓各參數(shù)值均顯著升高(P<0．01)；與2組比較，1組PRA、AngⅡ、夜間SBP、DBF、24hSBP均．顯著升高。 7)動(dòng)態(tài)血壓與左室質(zhì)量指數(shù)關(guān)系左室重量指數(shù)與夜間收縮壓和舒張壓的相關(guān)性比晝間更密切，與收縮壓相關(guān)性大于舒張壓，SIS、SID與L

7、VMI成負(fù)相關(guān)。 8)PCⅢ與聲學(xué)密度各參數(shù)之間的相關(guān)分析PCⅢ與CA11、CA12呈正相關(guān)，與PP11、PP12呈反相關(guān)。 結(jié)論:1)高血壓病人24h動(dòng)態(tài)血壓指標(biāo)較正常對(duì)照組顯著升高，給予纈沙坦或貝那普利后各項(xiàng)指標(biāo)顯著下降，聯(lián)合纈沙坦+貝那普利較分別應(yīng)用能更平穩(wěn)的控制血壓。分別應(yīng)用貝那普利或纈沙坦后，SI升高，二者比較未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，DSPPmRNA表達(dá)情況的變化，觀察不同濃度的兩種因子單獨(dú)作用情況下對(duì)細(xì)胞增殖和分化

8、的影響。然后選取兩種因子的適宜濃度進(jìn)行聯(lián)合作用觀察其對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖和分化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，100ng／m1BMP2和10ng／ml TGFβ1對(duì)DPSCs增殖和分化作用最明顯，TGFβ1+BMP<,2>聯(lián)合作用組第4天和第7天時(shí)，與其它各組之間堿性磷酸酶活性無顯著性差異(P>0.05)。第14天和21天時(shí)，TGF—β110ng組，BMP<,2>100ng組，TGF—βl lOng+BMP<,2>100ng組的堿性磷酸酶活性與對(duì)照組細(xì)胞

9、比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，堿性磷酸酶活性值均高于同一天的對(duì)照組，其中TGF一βl10ng+BMP<,2> 100ng組堿性磷酸酶活性增高明顯，與另外3組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。TGF—βl 10ng+BMP<,2>100ng聯(lián)合作用組DSPP基因的表達(dá)較TGF—βl 10ng及BMP<,2>100n明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 第四部分：成人牙髓干細(xì)胞與材料復(fù)合的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究為進(jìn)一步觀察牙髓

10、干細(xì)胞與生物材料復(fù)合后體內(nèi)外生長的特性，本實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞懸液與β—TCP復(fù)合培養(yǎng)1天，3天，7天，14天后用掃描電鏡對(duì)細(xì)胞材料復(fù)合物進(jìn)行了檢測(cè)。在此基礎(chǔ)上選取細(xì)胞材料復(fù)合培養(yǎng)3天的復(fù)合物回植于裸鼠背部皮下，4周、12周后取材，進(jìn)行HE染色、Manory染色以及免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)量和基質(zhì)分泌增多，生長良好。在體內(nèi)試驗(yàn)12周后可見不典型的牙本質(zhì)形成，以及纖維結(jié)締組織和小的血管，DSP和I型膠原陽性。