成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞的分離與培養(yǎng).pdf

1、糖尿病是一種嚴重危害人類健康的代謝性疾病，而傳統(tǒng)的藥物和胰島素治療方法卻不能根治該病。近年來，隨著移植技術(shù)的發(fā)展和免疫抑制劑的改進，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效，但是由于供體來源短缺，胰島移植治療糖尿病技術(shù)的應(yīng)用受到了制約。胰腺干細胞是存在于胰腺組織中的成體干細胞，能夠自我更新并具有多向分化潛能。出生后，胰腺導(dǎo)管組織仍然存在干細胞，稱為成體胰腺導(dǎo)管干細胞。體外分離增殖胰腺導(dǎo)管干細胞并誘導(dǎo)其分化形成功能性胰島移植治療糖尿病，是有效解

2、決供體短缺的途徑之一，具有重要的意義。但是，國內(nèi)至今尚無成年哺乳動物胰腺導(dǎo)管干細胞建系的研究。本研究以SD成年大鼠為試驗材料，建立了1例類胰腺導(dǎo)管干細胞系，并對其分離培養(yǎng)體系、生長特性、表達特性及裸鼠荷瘤等進行了探討。成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞系的建立和生物學(xué)特性的研究，對于進一步研究成年哺乳動物胰腺組織再生和利用細胞移植治療糖尿病具有重要的學(xué)術(shù)意義和潛在的應(yīng)用價值。
　　本研究的主要內(nèi)容包括：
　　1．成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細

3、胞系的建立
　　以成年大鼠胰腺組織為試驗材料，0.1 g/mLⅣ型膠原酶消化胰腺組織獲得單個胰腺細胞，Dextron葡聚糖不連續(xù)密度梯度離心分離得到胰腺導(dǎo)管細胞。RPMI-1640+10％FBS+0.11 g/L丙酮酸鈉+2.383 g/L Hepes基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)，原代上皮樣胰腺導(dǎo)管干細胞和少量成纖維細胞貼壁生長。0.25%胰蛋白酶+0.04 g/L EDTA·2Na消化傳代，逐漸剔除成纖維樣細胞及其它細胞，獲得純化的上皮樣胰腺

4、導(dǎo)管干細胞?？寺…h(huán)挑選單個細胞增殖而來的細胞簇，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液+10 ng/mL EGF擴增培養(yǎng)，傳代，建立1例成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞系。該細胞系已傳至33代。倒置顯微鏡下觀察類胰腺導(dǎo)管干細胞貼壁生長，呈多角形上皮樣；當(dāng)生長至80%融合時，呈“鋪路石”樣。傳代培養(yǎng)1~2 d，細胞生長緩慢，3~4 d，細胞開始倍增。從干細胞生長曲線和傳代情況看，該成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞具有無限增殖潛能。
　　以80%RPMI-1640+10%F

5、BS+10%DMSO為細胞保存液，采用4℃，30 min→－80℃，12 h→－196℃程序性降溫，液氮中已冷凍保存成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞86管，1×109個細胞；37℃水浴迅速解凍，成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞解凍成活率≥90.8%。
　　隨機取傳至31代的成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞擴增至單層，加入終濃度為0.1μg/mL的秋水仙素處理細胞5 h，0.4%氯化鉀低滲30 min，固定，滴片，染色，制備染色體標本。結(jié)果顯示成年大鼠類胰

6、腺導(dǎo)管干細胞染色體是正常的二倍體（2n=42）。
　　2．不同生長因子對成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞增殖的影響
　　以RPMI-1640+10%NBS為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別添加濃度為5、10、15 ng/mL的生長因子EGF、bFGF、IGF-Ⅱ或KGF，擴增成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞。采用CCK-8法測定第1~7 d的細胞數(shù)，繪制細胞生長曲線。結(jié)果顯示在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加這些生長因子均能促進成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞增殖，其中，添加15

7、 ng/mL EGF或10、15 ng/mL bFGF或10、15 ng/mL KGF，能夠顯著促進成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞增殖。
　　3．成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞的表達特征
　　隨機取傳至22代的成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞，采用免疫熒光化學(xué)反應(yīng)和流式細胞術(shù)檢測其蛋白表達特性。免疫熒光化學(xué)反應(yīng)結(jié)果顯示成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞表達 CK19，不表達胰島干細胞標記物（Nestin、Ngn3、Ptf1a、NeuroD2、Pdx-1）

8、、神經(jīng)干細胞標記物（Sox-2）、胚胎干細胞標記物（Ghrelin）及胰腺終末分化細胞標記物（Somatostatin、Secretin、Insulin、Glucagon、AKP）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示成年大鼠類胰腺導(dǎo)管干細胞表達Pax4、Pax6、Oct-4、Nanog和PCNA，不表達胚胎干細胞標記物CD15/SSEA-1、胰島干細胞標記物MafA和造血干細胞標記物（CD34、CD117/c-kit及CD45）。
　　4．成