人類新發(fā)MERS冠狀病毒木瓜樣蛋白酶結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能研究.pdf

1、背景:2012年6月,在一位沙特阿拉伯人身上首次發(fā)現(xiàn)一種類似于急性嚴(yán)重呼吸綜合征冠狀病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS-CoV)的病毒,隨即其便證明并命名為中東呼吸道綜合征冠狀病毒(Middle East Resperatory syndrome,MERS-CoV)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),截止2014年2月28日,MERS-CoV已感染184例,其中80例死亡,死亡率近45％。MERS-Co

2、V基因組由正義、單鏈RNA組成,且其編碼的兩個(gè)大復(fù)制酶多聚蛋白pp1a和pp1ab主要是由基因組前2/3部分翻譯得到。pp1a和pp1ab被木瓜樣蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)和3C樣蛋白酶(Chymotrypsin-like protease,3CLpro)切割成16個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(nsp1-16)。Nsp1-16經(jīng)過(guò)組裝產(chǎn)生一個(gè)多功能、膜結(jié)合且可以介導(dǎo)完成病毒基因組復(fù)制和結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的復(fù)制酶聚合體

3、(Replicase complex,RC)。區(qū)別于已知大多數(shù)編碼兩個(gè)木瓜樣蛋白酶(PLP1和PLP2)的冠狀病毒是,MERS-CoV僅編碼一個(gè)木瓜樣蛋白酶,PLpro。MERS nsp3編碼7個(gè)小的功能結(jié)構(gòu)域,其中以PLpro為核心,且PLpro C端TM跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⑵涠ㄎ挥谀ど稀ERS-CoV感染出現(xiàn)后,其便成為醫(yī)學(xué)界研究的焦點(diǎn)和生物學(xué)界研究熱點(diǎn)之一,本實(shí)驗(yàn)室率先針對(duì)MERS-CoV蛋白酶的結(jié)構(gòu)學(xué)特征和生物學(xué)功能展開(kāi)深入研究。

4、r>　　目的:以人類MERS-CoV帶跨膜結(jié)構(gòu)域的木瓜樣蛋白酶PLpro-TM為研究對(duì)象,MERS PLpro高級(jí)結(jié)構(gòu)、具體生物學(xué)功能以及其對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)IFN表達(dá)調(diào)控的研究,為進(jìn)一步探究人類新冠狀病毒 MERS的致病機(jī)理提供理論依據(jù)和新抗病毒藥物的研發(fā)提供靶點(diǎn)。
　　方法:首先,人工合成MERS-CoV PLpro-TM和各個(gè)酶切底物nsp1-2,nsp2-3和nsp3-4。其次,利用PCR技術(shù)克隆得到不含跨膜結(jié)構(gòu)域的MERS P

5、Lpro,并利用PCR定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑Lpro-TM/PLpro蛋白酶催化活性中心Cys-His-Asp分別突變?yōu)?Ala,從而構(gòu)建出三種酶活性缺失突變體;同時(shí)構(gòu)建出各個(gè)蛋白酶酶切底物的LXGGA相應(yīng)突變體。最后,利用蛋白印跡法、雙熒光素酶報(bào)告基因和免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)MERS PLpro-TM的生物學(xué)功能及其對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)IFN表達(dá)調(diào)控。對(duì)其機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究,首先利用 Western blot技術(shù)檢測(cè) MERS-CoV PLpro-

6、TM對(duì)不同蛋白酶底物的切割情況,并利用 PCR定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建PLpro-TM/PLpro酶活性突變體及蛋白酶底物點(diǎn)突變體,利用Western blotting技術(shù)檢測(cè)突變體對(duì) PLpro-TM酶活性影響及突變體對(duì)蛋白酶底物切割的影響。其次,雙熒光素報(bào)告基因檢測(cè) MERS PLpro-TM/PLpro及其蛋白酶催化活性突變體對(duì)宿主細(xì)胞內(nèi)IFN表達(dá)調(diào)控;Western blotting檢測(cè)MERS PLpro-TM對(duì)細(xì)胞內(nèi)IRF3磷酸化水

7、平影響;間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)MERS PLpro-TM對(duì)細(xì)胞內(nèi)IRF3入核活化的影響情況。最后Western blotting檢測(cè)MERS PLpro-TM/PLpro對(duì)細(xì)胞內(nèi)泛素化水平的影響。
　　結(jié)果:1.MERS PLpro-TM高級(jí)空間結(jié)構(gòu)研究:以SARS PLpro蛋白酶為預(yù)測(cè)模板,利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)MERS PLpro高級(jí)空間結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,MERS-CoV PLpro與SARS-CoV PLpro及兩者的蛋白酶催化活

8、性位點(diǎn)的高級(jí)空間結(jié)構(gòu)存在一定程度的相似性。
　　2.MERS PLpro-TM特異性地切割釋放底物蛋白:在HEK293T細(xì)胞中,MERS PLpro-TM可以完全切割釋放蛋白酶底物 nsp2-3,部分切割釋放底物 nsp1-2和nsp3-4。分別突變MERS PLpro-TM的各個(gè)蛋白酶催化活性中心后,發(fā)現(xiàn)各個(gè)蛋白酶底物的切割釋放產(chǎn)物量均有所降低。此外,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)?shù)孜锏鞍酌傅母叨缺Ｊ匦蛄斜煌蛔兒?PLpro-TM對(duì)底物蛋白酶的

9、切割釋放明顯減弱。提示MERS-CoV PLpro-TM特異性識(shí)別并切割底物蛋白酶的高度保守序列,且此切割作用受PLpro-TM蛋白酶催化活性位點(diǎn)影響。
　　3.MERS PLpro-TM是人類冠狀病毒編碼的一種新 IFN拮抗蛋白:在 HEK293T細(xì)胞中,MERS PLpro-TM及其一系列蛋白酶活性突變體均可抑制 RIG-IN介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)IFN表達(dá),并通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)IRF3磷酸化進(jìn)而破壞IRF3通路的活化,暗示著MERS-Co

10、V PLpro-TM主要通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)IRF3通路的活化從而抑制干擾素表達(dá)。
　　4.MERS PLpro-TM是人類冠狀病毒編碼的一種新 DUB酶:將泛素分子(HA-Ub,HA-Ub K48,HA-Ub K63)分別與MERS PLpro/PLpro-TM基因共同轉(zhuǎn)入HEK293T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)MERS PLpro/PLpro-TM能有效地去除細(xì)胞內(nèi)泛素化修飾的蛋白(包括K63、K48修飾的泛素化),從而證實(shí)MERS PLpro-T

11、M/PLpro具有細(xì)胞內(nèi) DUB活性,且 PLpro的DUB活性存在蛋白酶催化活性依賴性,然而 MERS PLpro-TM不存在此種依賴性。提示MERS PLpro的蛋白酶活性與其DUB活性存在必然聯(lián)系,且MERS PLpro-TM的DUB活性呈現(xiàn)一定程度的TM依賴性。
　　結(jié)論:MERS-CoV編碼的木瓜樣蛋白酶 PLpro-TM通過(guò)識(shí)別高度保守序列LXGG完成對(duì)蛋白酶底物的特異性切割,且此活性主要依賴于其蛋白酶催化活性中心;同