茶陵野生稻中兩個(gè)低溫誘導(dǎo)基因OrCr1與OrCr2的克隆與功能分析.pdf

1、茶陵野生稻是世界分布最北的兩個(gè)野生稻之一，在湖南茶陵(26°50′N)與長沙(28°13′N)均能自然越冬，耐冷性極強(qiáng)。為了探索其耐冷的分子機(jī)理并克隆其耐冷相關(guān)基因，近年里，我們采用Affymetrix60K水稻基因表達(dá)芯片分析了其低溫誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄組變化，鑒別出一些轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)與下調(diào)的基因。其中OrCrl(Oryzarufipogoncoldresponsivegene1)與OrCr2是兩個(gè)受低溫誘導(dǎo)而顯著上調(diào)的基因。
　　

2、 以茶陵野生稻mRNA為模板，通過RT-PCR法獲得了包含OrCr1與OrCr2基因完整ORF(openreadingframe)的cDNA克隆；根據(jù)它們的ORFs序列進(jìn)行預(yù)測，OrCr1基因編碼一個(gè)包含492個(gè)氨基酸殘基的蛋白，理論分子量為523.207kD，pI=6.21，經(jīng)蛋白質(zhì)相似性比對，其編碼蛋白與日本晴AK099722.1基因編碼的一可能的鋅指蛋白家族成員(putativeCOSTANS-likeB-boxzincfinge

3、rprotein)相差12個(gè)堿基，相似性為93％；OrCr2編碼一個(gè)包含169個(gè)氨基酸殘基的蛋白，理論分子量為17.467kD，pI=10.06，經(jīng)蛋白質(zhì)相似性比對，其編碼蛋白與日本晴AK108484.1基因編碼的一可能的富含亮氨酸重復(fù)序列的類受體蛋白激酶前體(putativeleucine-richrepeatreceptor-likekinase2precursor)的氨基酸殘基序列完全一致。對它們可能的啟動(dòng)子區(qū)域序列進(jìn)行分析，分別

4、找到3個(gè)及2個(gè)與逆境反應(yīng)有關(guān)的順式作用元件。
　　 為了探明這兩個(gè)基因是否具有耐冷或其它作用，構(gòu)建了由2×CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pCAMBIA1300-OrCr1/2植物表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了粳稻品種中花11號(hào)，獲得了26個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)OrCr1基因T0代水稻植株與21個(gè)轉(zhuǎn)OrCr2基因T0代水稻植株。對T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片中游離脯氨酸含量進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)基因水稻植株冷處理前后，游離脯氨酸含量均高于野